Приложение 4
к приказу Минздравмедпрома России
и Госкомсанэпиднадзора России
от 19.04.95 N 101/46
Методические указания
по лабораторным методам диагностики гриппа
и других ОРЗ
Современные методы лабораторного обследования больных с острыми респираторными вирусными инфекциями включают изоляцию вирусов, индикацию вирусных антигенов в материалах от больных (быстрая диагностика) и выявление специфических антител в сыворотках больных в острой фазе инфекции и стадии реконвалесценции.
1. Выделение и идентификация респираторных вирусов
Частота выделения респираторных вирусов зависит от сроков взятия материалов от больных, условий их хранения, доставки и времени первичной обработки. Решающее значение имеет ассортимент и качество клеточных культур и куриных эмбрионов, на которых проводят изоляцию вирусов.
Рекомендуемый состав культур для изоляции вирусов гриппа и ОРЗ:
1) первичная культура клеток почек эмбриона человека (ПЭЧ);
2) перевиваемые культуры клеток МДСК, НеLа (или НЕр2);
3) фибробласты легкого эмбриона человека (ЛЭЧ).
Материалом для выделения вирусов служат отделяемое носа, зева, конъюнктивы, а также секционный материал (ткани легкого, кусочки бронхов и др.).
Материал отбирают с помощью стерильного тампона, который погружают затем в пробирки с 5,0 мл среды Игла или среды 199 с антибиотиками и немедленно направляют в лабораторию, где тампоны с вирусным материалом отжимают в среду, материал центрифугируют в течение 20 мин при 2000-3000 об/мин и температуре +4град.С или используют в неосветленном виде.
Кусочки секционного материала растирают в фарфоровой ступке со стеклянным песком, добавляют 10-кратное количество раствора Хенкса, взвесь ресуспендируют, после чего осветляют центрифугированием. Надосадочную жидкость используют для заражения куриных эмбрионов или тканевых культур.
1.1. Изоляция и идентификация вирусов гриппа
Для выделения вирусов гриппа исследуемые материалы после их первичной обработки вводят по 0,1 мл в амниотическую полость и по 0,2 мл в аллантоисную полость 10-дневных куриных эмбрионов.
Заражение проводят в затемненном боксе через боковую поверхность скорлупы, направляя иглу сначала в амниотическую, а затем в аллантоисную полости, предварительно сделав дополнительный прокол в скорлупе над воздушной камерой. Материалом от одного больного заражают 3 эмбриона.
Зараженные эмбрионы инкубируют в термостате 72 часа при +(33-34) град.С. После инкубации эмбрионы помещают на ночь в рефрижератор при +4 град.С.
Индикацию вируса гриппа осуществляют в реакции гемагглютинации (РГА) путем добавления 0,5 мл 1% суспензии отмытых эритроцитов кур к 0,5 мл вируссодержащего материала. Результаты РГА учитывают после 30-минутного оседания эритроцитов в лунках панелей при комнатной температуре.
При отсутствии агглютинации эритроцитов необходимо провести 3 дополнительных пассажа путем заражения эмбрионов смесью амниотической и аллантоисной жидкостей от предыдущего пассажа. В случае отрицательных результатов РГА после 3 пассажей исследование материалов прекращают.
Идентификацию вирусов гриппа проводят в РТГА.
Для этого к 0,2 мл последовательных разведений типоспецифических иммунных сывороток добавляют по 0,2 мл рабочей дозы вируса в количестве 4 гемагглютинирующих единиц (ГЕ). Одной ГЕ считают последнее разведение вируса, дающее отчетливую гемагглютинацию.
После 1-часового контакта сыворотки с вирусом при комнатной температуре в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1% взвеси куриных эритроцитов. Титром сыворотки считают ее последнее разведение, блокирующее 4 ГЕ вируса.
Типовую принадлежность вируса определяют по ингибиции гемагглютинации, которая должна быть зарегистрирована в разведении не менее чем 1:20.
Выделение вирусов гриппа может быть осуществлено на чувствительных культурах клеток, чаще всего МДСК. Для этого в пробирки с монослоем, отмытым физиологическим фосфатным буфером или раствором Хенкса, вносят по 0,2 мл материала от больного. Через 1 ч адсорбции при +38 град.С в культуры добавляют по 1,5 мл поддерживающей среды (199, Игла с антибиотиками) и помещают в термостат при +33 град.С.
Индикацию, типирование и дополнительные пассажи вирусов гриппа проводят, как указано выше. Кроме того, инфицированные культуры 1 раз в день микроскопируют для оценки цитопатогенного действия вирусов.
1.2. Изоляция и идентификация других возбудителей ОРЗ
Изоляцию аденовирусов, парагриппозных вирусов, РС-вируса, коронавирусов, вирусов герпеса и др. проводят на клеточных культурах (ПЭЧ, ЛЭЧ и Нер-2). Наиболее чувствительной к различным вирусам является клеточная культура ПЭЧ. В чувствительные культуры вносят по 0,2 мл материала от больного. Через 30-60 мин адсорбции вируса на клетках в культуры вносят по 0,8 мл поддерживающей среды Игла с антибиотиками (100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина) и с 2% инактивированной фетальной сыворотки. Зараженные культуры инкубируют при температуре +36 град.С до появления в них проявлений цитопатогенного действия (ЦПД).
Индикацию парагриппозных вирусов проводят по ЦПД и гемадсорбции с 0,4% взвесью эритроцитов морской свинки (20 мин при комнатной температуре), а остальных вирусов - по характерному цитопатогенному действию.
Если при первичном заражении вирус не был выявлен ни в одном из тестов, материалы дополнительно пассируют еще 2 раза в тех же условиях.
Идентификацию вирусов ОРЗ проводят в чувствительных тканевых культурах с помощью реакции нейтрализации (РН) со специфическими иммунными сыворотками. Вируссодержащую культуральную жидкость в дозе 100 ТИД50/0,2 мл в объеме О,2 мл смешивают с О,2 мл каждой из типоспецифических иммунных сывороток, взятых в разведении 1:20. Смесь вируса и сыворотки выдерживают 2 часа при комнатной температуре, после чего по 0,2 мл каждой смеси вносят в 2 пробирки с монослоем чувствительных клеток, затем в пробирки добавляют по 0,8 мл поддерживающей среды. Инфицированные и контрольные культуры клеток инкубируют при температуре +36 град.С. Параллельно типоспецифические сыворотки контролируют в отношении их активности к типовым эталонным штаммам.
Учет реакции проводят по ингибиции цитопатогенного действия (для аденовирусов, РС, простого герпеса), гемадсорбции (для парагриппозных вирусов) в день, когда типируемый вирус вызвал выраженное ЦПД клеток в контрольных культурах без сыворотки (при отсутствии дегенерации в контрольных посевах неинфицированных клеток и в контролях диагностических сывороток), в то время как эталонные штаммы полностью нейтрализованы типоспецифическими сыворотками. Тип выделенного штамма определяют по сыворотке, которая полностью предохранила клетки от дегенерации.