Об утверждении Методических указаний по разработке нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения (с изменениями на 22 декабря 2016 года)

Таблица 1.3.1.

     

Состав питательной среды Гольдберга

Питательную среду для культивирования готовят на искусственной морской воде или на морской природной воде (черноморской, беломорской, балтийской, каспийской и т.д.), которую предварительно отбирают в незагрязненном районе. Морскую воду фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 3,5 мкм). Дважды стерилизуют, нагревая до температуры 75-80°С и охлаждая до комнатной температуры. В подготовленную таким образом морскую воду добавляют растворы N 1, N 2 и N 3 (см. таблицу 1.3.1). Затем среду стерилизуют третий раз, охлаждают и добавляют раствор N 4.

Приготовленную вышеописанным способом среду хранят в темном месте при комнатной температуре. Исходные растворы для приготовления среды хранят в холодильнике, в случае помутнения производят их замену.

Культивируют водоросли в конических колбах объемом 250-300 мл, закрытых фольгой или ватно-марлевой пробкой, в люминостате или климатостате, избегая попадания прямых солнечных лучей. Освещенность 3000-6000 люкс. Лампы дневного света размещают на расстоянии 30-40 см от поверхности культуры. Соблюдается световой суточный ритм. Температура при культивировании водорослей 20 ± 2°С. Культуру водорослей периодически перемешивают, встряхивая 1-2 раза в сутки.

Водоросли рекомендуется один раз в десять дней пересевать. Для этого в чистую простерилизованную колбу объемом 250 см со свежей средой (100-150 мл) над пламенем спиртовки приливают примерно 15-20 см верхнего росткового слоя из колбы ранее культивируемых водорослей. При этом получают начальную плотность клеток в колбе для культивирования, примерно 300 тыс.кл/см. Колбу закрывают ватно-марлевыми пробками или фольгой, перемешивают, записывают на колбе название культуры, дату посева и ставят в люминостат.

В течение дня содержимое колбы следует перемешивать 1-2 раза.

1.4. Проведение исследований

Опыты проводят при оптимальной температуре и освещении, как и культивирование водорослей (п.1.3 приложения 3). Используют водоросли в экспоненциальной фазе роста, что соответствует трехсуточной культуре водорослей после пересева. Плотность культуры в колбе в это время достигает примерно 5 млн.кл/мл.

В опыте используют начальную плотность клеток 25 тыс.кл/см. Для этого нужная плотность клеток в опыте достигается расчетом, исходя из объема исследуемой концентрации вещества (например, 100 см) и численности клеток в культуре в экспоненциальной фазе роста (5 млн.кл/см). В указанном случае в опытную и контрольную среду добавляется по 0,5 см трехсуточной культуры водорослей.

Периодически (не реже 1 раза в месяц) необходимо проводить контроль физиологической чувствительности водорослей. Для этого используют эталонное химическое вещество - двухромовокислый калий КCrO марки "хч" или стандарт-титр калия двухромокислого. Готовят маточный раствор двухромовокислого калия концентрацией 1 г/м. Далее методом разбавления готовят серию растворов с концентрациями 1,0; 2,5; 5,0; 7,5 и 10,0 мг/дм. Исследование проводят в течение 96 ч. На основании полученных результатов рассчитывают среднюю концентрацию КCrO, вызывающую уменьшение численности клеток на 50% за 96 ч (ЛК за 96 ч). Если полученное значение ЛК находится в интервале 5,8-10,0 мг/дм, то культура водорослей может быть использована для экспериментов.

Если полученные значения ЛК не попадают в интервал 5,8-10,0 мг/дм, то эксперименты с водорослями не проводят, выясняют причину (условия культивирования, состав культуральной среды и прочее). Иногда культуру водорослей заменяют и проводят эксперименты заново.

При постановке острых и хронических экспериментов в контрольные и опытные колбы емкостью 250 см наливают по 100 см (в колбы емкостью 100 см наливают по 50 см) контрольной среды и исследуемые концентрации вещества. Контролем служит среда Гольдберга. Исследуемые концентрации веществ также готовят на среде Гольдберга.

Затем в опытные и контрольные колбы пипеткой добавляют по 0,5 см (0,25 см) культуры водорослей в экспоненциальной фазе роста.

Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками или фольгой, их содержимое тщательно перемешивают и в каждой колбе определяют исходную численность клеток, которая должна составлять 25 тыс.кл/мл. Колбы помещают в люминостат (или в климатостат) и экспонируют в течение трех суток (острый) или четырнадцати суток (хронический) эксперимент.

В эксперименте должно быть исследовано не менее 5 концентраций вещества. Повторность трехкратная.

Эксперименты на водорослях проводятся в 2 этапа: предварительный и основной (окончательный).

В предварительном остром эксперименте находят интервал токсичных концентраций. Опыты проводят в широком диапазоне концентраций вещества, которые отличаются в геометрической прогрессии (коэффициент 10). Например, 0,01; 0,1; 1,0; 10,0 мг/л и т.д. Исследуют не менее пяти концентраций в двух повторностях. По результатам эксперимента определяется диапазон концентраций для основного острого и хронического эксперимента.

В основном остром и хроническом эксперименте шаг между концентрациями различается в 2-5 раз. Исследуют не менее пяти концентраций в трех повторностях.

Подсчет клеток водорослей проводят в остром опыте ежедневно, в хроническом - на 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14 сутки.

На 14 сутки от начала эксперимента опыт прекращают и устанавливают, оказывают ли исследуемые концентрации вещества хроническое токсическое (или эвтрофирующее) дейст

вие на водоросли.

1.5. Учет и анализ результатов

Для подсчета численности клеток под микроскопом используют счетную камеру Нажотта объемом 0,01 см (или камеру Горяева).

Подсчет клеток в камере Нажотта осуществляют следующим образом. Камеру Нажотта и покровное стекло толщиной 0,2-0,4 мм промывают дистиллированной водой и вытирают насухо. Из каждой контрольной или опытной колбы каплю суспензии водорослей наносят на середину камеры, покровное стекло плотно прижимают к поверхности камеры (в камере не должно быть пузырьков воздуха), дают отстояться 1-2 минуты, после чего начинают подсчет в пяти правых верхних и пяти правых нижних вертикальных счетных полосах. Затем выводят среднее количество клеток в одной полосе. При большом разбросе клеток в полосах просчитывают 10 верхних и 10 нижних полос. Полученное среднее число клеток в одной полосе умножают на коэффициент 1600 и величину разведения (например, при разведении культуры в 10 раз среднее число клеток в одной полосе умножают на 10), определяя численность клеток в 1 см.