Об утверждении Методических указаний по разработке нормативов качества воды водных объектов рыбохозяйственного значения, в том числе нормативов предельно допустимых концентраций вредных веществ в водах водных объектов рыбохозяйственного значения (с изменениями на 22 декабря 2016 года)

Таблица 1.3.1.

Питательные среды Прата и Успенского для культивирования водорослей готовят на дистиллированной воде. Чтобы избежать образования осадка в питательной среде, каждый ее компонент предварительно готовят отдельно в 100 см дистиллированной воды (исходный раствор). Исходные растворы хранят в холодильнике при температуре от +2°С до +4°С в течение месяца, в случае помутнения производят их замену.

Из исходных растворов каждого вещества (кроме солей железа) по 1 см добавляют в колбу объемом 1 дм, наполовину наполненную дистиллированной водой (добавление в последовательности расположения веществ в таблице 1.3.1.). Доливают колбу дистиллированной водой до объема 1 дм, перемешивают, после чего питательную среду стерилизуют в автоклаве (30 мин. при 1 атм.) или кипячением на водяной бане в течение 30 мин. После охлаждения стерилизованной среды в нее добавляют соль железа в количестве 1 см на 1 дм среды (для среды Прата 1%-й раствор FeCl·6HO; для среды Успенского 1% - растворы одного из солей железа FeCl, Fe(SO), Fe(NH)(SO) или цитрат железа).

Приготовленную среду хранят до использования в темном месте при комнатной температуре.

Культивируют водоросли в люминостате в конических колбах объемом 250-300 см, закрытых фольгой или ватно-марлевым тампоном. Освещенность 3000-6000 люкс. Соблюдается световой суточный ритм. Культуру водорослей периодически перемешивают, встряхивая 1-2 раза в сутки. Температура при культивировании водорослей 20 ± 2°С.

Повышение температуры до 25°С и выше усиливает токсическое действие, а понижение ее до 12-15°С задерживает проявление эффекта и снижает действие вещества.

Водоросли рекомендуется один раз в десять дней пересевать. Для этого в чистую простерилизованную колбу объемом 250 см со свежей средой (100-150 мл) над пламенем спиртовки приливают примерно 15-20 см верхнего росткового слоя из колбы ранее культивируемых водорослей. При этом получают начальную плотность клеток в колбе для культивирования, примерно 300 тыс.кл/см. Колбу закрывают ватно-марлевым тампоном или фольгой, перемешивают, записывают на колбе название культуры, дату посева и ставят в люминостат. В течение дня содержимое колбы перемешив

ают 1-2 раза.

1.4. Проведение исследований

Опыты проводят при оптимальной температуре и освещении (п.1.3 приложения 2). Используют водоросли в экспоненциальной фазе роста, что соответствует трехсуточной культуре водорослей после пересева. Плотность культуры в колбе в это время достигает примерно 5 млн.кл/см.

В опыте используют начальную плотность клеток 25 тыс.кл/см. Для этого нужная плотность клеток в опыте достигается расчетом, исходя из объема тестируемой (контрольной, опытной) воды (например, 100 мл) и численности клеток в культуре в экспоненциальной фазе роста (примерно 5 млн.кл/см). В указанном случае в опытную и контрольную воду добавляется по 0,5 см трехсуточной культуры водорослей.

Периодически (не реже 1 раза в месяц) необходимо проводить контроль физиологической чувствительности водорослей. Для этого используют стандартное (эталонное) вещество - двухромовокислый калий КCrO марки химически чистый ("хч") или стандарт-титр калия двухромовокислого.

Готовят маточный раствор двухромокислого калия концентрацией 1г/дм. Далее методом разбавления - серию растворов с концентрациями 0,12; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 мг/л. Исследование проводят в течение 48 ч в трех повторностях. По результатам опыта рассчитывают среднюю концентрацию КCrO, вызывающую уменьшение численности клеток на 50% за 48 ч (ЛК за 48 ч). Если полученное значение ЛК находится в интервале 1,3-2,5 мг/л, то культура водорослей может быть использована для экспериментов.

Если полученные значения ЛК не попадают в указанный интервал, то эксперименты с водорослями не проводят, выясняют причину (условия культивирования, состав культуральной среды и проч.). Иногда культуру водорослей заменяют и проводят эксперименты заново.

При постановке острых и хронических экспериментов в контрольные и опытные колбы емкостью 250 мл наливают по 100 мл (в колбы емкостью 100 мл - по 50 мл) контрольной среды или исследуемой концентрации вещества. Контролем служит культуральная среда, на которой культивируются водоросли (среда Прата или среда Успенского N 1). Концентрации веществ также готовят на соответствующей среде.

В опытные и контрольные колбы пипеткой добавляют по 0,5 см (0,25 см) культуры водорослей в экспоненциальной фазе роста.

Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками или фольгой, их содержимое тщательно перемешивают и в каждой колбе определяют исходную численность клеток, которая должна составлять 25 тыс.кл/см. Колбы помещают в люминостат.

В эксперименте должно быть исследовано не менее 5 концентраций вещества. Повторность трехкратная.

Эксперименты на водорослях проводятся в 2 этапа: предварительный и основной (окончательный).

В предварительном остром эксперименте находят интервал токсичных концентраций. Опыты проводят в широком диапазоне концентраций вещества, которые отличаются в геометрической прогрессии (коэффициент 10). Например, 0,01; 0,1; 1,0; 10,0 мг/л и т.д. Исследуют не менее пяти концентраций в двух повторностях. По результатам эксперимента определяется диапазон концентраций для основного острого и хронического экспериментов.

В основном остром и хроническом экспериментах шаг между концентрациями изменяется в 2-5 раз. Исследуют не менее пяти концентраций в трех повторностях.

Подсчет клеток водорослей проводят в остром опыте ежедневно, в хроническом - на 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14 сутки.

На 14 сутки от начала эксперимента опыт прекращают и устанавливают, оказывают ли исследуемые концентрации вещества хроническое токсическое или эвтрофирующее действие на

 водоросли.

1.5. Учет и анализ результатов

Основным критерием токсичности действия веществ на тест-объект следует считать изменение численности клеток водорослей, последовательность прохождения ими всех стадий развития и их способности к размножению.