РТГА выполняют в соответствии с наставлением по постановке этой реакции, прилагаемым к набору ингредиентов для РТГА, который выпускает предприятие-изготовитель. В качестве дополнения к этому наставлению необходимо принимать во внимание следующее.
1. Эритроциты от разных гусей, используемые для РТГА, нельзя смешивать, так как смесь может давать неспецифическую агглютинацию. Рабочую взвесь эритроцитов готовят перед самым употреблением. Результаты РГА и РТГА учитывают следующим образом. Равномерный тонкий слой эритроцитов, выстилающий дно лунки по всей кривизне, оценивают как полную гемагглютинацию (при оценке по системе "четырех крестов" ++++). В случае образования эритроцитами кольца на менее однородном или более тонком слое осадка регистрируют частичную гемагглютинацию (+++ или ++). Минимальная гемагглютинация - осадок в виде пуговки на тонком или фрагментированном слое эритроцитов (+ или ±). При полном отсутствии гемагглютинации осадок имеет форму компактной пуговки без признаков окружающего тонкого слоя эритроцитов (-). Результаты ++++, +++ и ++ расценивают как свидетельство наличия достаточного количества антигена в данной лунке (положительная реакция в РГА, отрицательная реакция в РТГА). Результаты +, ± и - расцениваются как отрицательная реакция в РГА или положительная в РТГА.
2. В РТГА антиген используют в объеме 0,2 мл или 0,025 (микротитратор Такачи) вместо 0,4 мл или 0,05 мл (микротитратор Такачи), употребляемых при титровании антигена в РГА. Поэтому, чтобы определить разведение антигена, содержащее 4 единицы, для использования в РТГА отсчитывают от конечной точки титрования антигена не 3, а 4 разведения, а для рабочего разведения, содержащего 8 единиц - 5 разведений. Так, при титре антигена в РГА 1:320 4 АЕ содержится в разведении 1:40, 8 АЕ - в разведении 1:20.
3. При выполнении РТГА в объеме 0,8 мл рабочее разведение антигена должно содержать 8 единиц в 0,2 мл, при общем объеме 0,1 мл (микротитратор Такачи) - работают с 4 единицами антигена в 0,025 мл, так как титр антигена при работе с малыми объемами в 2 раза уменьшается.
4. Неспецифические ингибиторы гемагглютинации, обычно содержащиеся в сыворотках, не адсорбируются на каолин, если проба сильно гемолизирована, контаминирована бактериями и длительное время хранилась при +4°С. В таких случаях для удаления ингибиторов используют экстрагирование ацетоном. Для этого 1 объем сыворотки (0,1 мл) разводят физиологическим раствором в 10 раз (0,9 мл), охлаждают на льду и добавляют 12 объемов (по отношению к разведенной сыворотке) холодного ацетона (12 мл). После экстрагирования в течение 5 минут смесь центрифугируют 5 минут при 2500 об/мин и +4°С. Надосадочную жидкость осторожно (не взболтать осадок!) удаляют. Осадок ресуспендируют в прежнем объеме (12 мл) охлажденного ацетона, энергично встряхивают, экстрагируют 1 час, выдерживая на льду, периодически встряхивая, центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок высушивают под вакуумом при комнатной температуре или струей воздуха, создаваемой вентилятором. Процедуру испарения ацетона в последнем случае следует проводить в вытяжном шкафу или хорошо проветриваемом помещении. Высушенный осадок разводят буферным раствором рН 9,0 из набора для гемагглютинации так, чтобы получить разведение сыворотки 1:10 (в 1 мл). Растворение осадка заканчивается в течение нескольких часов при комнатной температуре (при периодическом встряхивании) или в течение ночи в рефрижераторе.
Через 8-10 месяцев хранения сывороток при + 4°С неспецифические ингибиторы не удается удалить из гемолизированных и контаминированных бактериями проб даже обработкой ацетоном. Кроме того, энзиматическая деятельность бактерий может приводить к полному разрушению специфических антител в сыворотке.
5. Обработка 25% взвесью каолина частично или полностью удаляет из сыворотки иммуноглобулины класса М, или ранние специфические антитела, тогда как экстрагирование ацетоном - более щадящий метод обработки. Тем не менее метод удаления неспецифических ингибиторов каолином рекомендуют для использования, как более простой, а изменение напряженности гуморального иммунитета при заболевании выявляют по изменению титра специфических иммуноглобулинов класса G при исследовании первой и повторных проб.
6. Обработанные для исследования в РТГА сыворотки в разведении 1:10 сохраняют титр специфических антител почти без изменений в течение нескольких недель, если их хранить в хорошо закрытых резиновыми пробками флаконах или запаянных ампулах.
7. В целях экономии ингредиентов рекомендуется проводить обследование сывороток в РТГА в два этапа: а) исследовать все сыворотки в разведении 1:10, 1:20 и 1:40; б) сыворотки, подавляющие гемагглютинацию в титре 1:40, исследовать повторно в разведениях до 1:1280 - 1:2560.