В качестве материала для заражения (инокулята) используют суспензии, приготовленные из сгустка крови или гепаринизированной крови, сыворотку, плазму и спинно-мозговую жидкость больных. Во избежание аутоинтерферирующего действия вируса и токсического эффекта инокулята сыворотку, плазму и спинно-мозговую жидкость разводят физиологическим раствором 1:10, 1:50. Из мозга людей, умерших от клещевого энцефалита, готовят после измельчения в стерильных фарфоровых ступках 10% суспензии на физиологическом растворе, на растворе Хенкса или среде для культуры клеток рН 7,0-7,2, если суспензию используют для заражения культур клеток. К физиологическому раствору и растворам, на которых готовят суспензии, в качестве стабилизатора вируса добавляют бычий альбумин (0,75%) или инактивированные прогреванием и проверенные на отсутствие специфических антител сыворотки крупного рогатого скота, эмбрионов коров, лошади или кролика до 30%. Полученные суспензии перед инокуляцией осветляют центрифугированием при 1500-2000 об/мин 10-15 минут. Для заражения используют недосадочную жидкость. Оставшиеся суспензии хранят при температуре не выше -20°С для реизоляции агентов.
Исследование клещей, собранных в природных очагах, а также крови и органов животных с целью выделения вируса проводят с помощью тех же методов.
Материалы, приготовленные для вирусологического обследования в культурах клеток и на животных, должны быть бактериологически стерильными. Для соблюдения этого условия: а) загрязненные материалы обрабатывают антибиотиками (пенициллин - 1000 единиц и стрептомицин - 500 единиц на 1 мл); б) в растворы, используемые для приготовления суспензий, добавляют антибиотики в такой же концентрации; клещей перед растиранием в ступке отмывают спиртом или эфиром, а затем стерильным физиологическим раствором с антибиотиками.
Выбор метода выделения вируса. Для выделения возбудителя КЭ наиболее пригодными являются перевиваемая культура клеток СПЭВ и белые мыши в возрасте 1-3 суток, так как они обладают высокой чувствительностью к вирусу. Несколько менее чувствительна к вирусу КЭ культура клеток куриного эмбриона, но при отсутствии клеток СПЭВ и новорожденных белых мышей ее также можно использовать для указанной цели.
Наиболее надежно выделять вирус параллельным заражением исследуемым материалом клеток СПЭВ (2 пассажа) и белых мышей. На практике чаще всего приходится ограничиваться либо заражением культуры клеток, либо заражением белых мышей в возрасте 1-3 суток.
В случае выделения вируса в культуре клеток идентификацию (а при использовании культур клеток куриного эмбриона и индикацию) выделенного агента проводят методом флуоресцирующих антител на втором пассаже исследуемого материала.
При необходимости длительного хранения вируса культуральной жидкостью заражают молодых белых мышей весом 6-7 г и хранят мозг заболевших мышей при температуре не выше -20°С.
Заражение белых мышей. Обследуемый инокулят непосредственно после приготовления вводят новорожденным белым мышам в мозг в объеме 0,01-0,02 мл. Каждой пробой заражают по 6-8 животных. Срок наблюдения составляет 14 дней. Мозг мышей, заболевших и погибших через 3 дня и более после заражения, используют для последующих пассажей.
Заражение культур клеток. Каждой пробой заражают по 2-4 пробирки с монослоем по 0,1 мл инокулята на пробирку. Адсорбцию вируса на клетках проводят в течение 1 часа при комнатной температуре или 30 минут при +37°С, после чего в пробирки вносят поддерживающую среду (среда 199 на растворе Эрла, рН 7,6) с 3% прогретой при +56°С (инактивированной) бычьей сыворотки. В зависимости от количества вируса в инокуляте накопление его достигает максимума через 3-6 суток инкубации культуры клеток. На третьи сутки делают второй пассаж исследуемого материала ин витро, за которым наблюдают в течение 7 дней.
Размножение вируса КЭ в клетках СПЭВ приводит к разрушению клеток, обусловленному цитопатической активностью вируса. Наблюдение за инфицированными культурами обычно проводят до наступления неспецифической дегенерации клеток в контрольных пробирках. Во всех клетках другого вида вирус КЭ размножается без признаков регулярного цитопатического действия. Иногда в сомнительных случаях для выявления вируса требуется провести дополнительные пассажи.
Индикация и идентификация выделенного вируса КЭ. В культуре клеток СПЭВ вирус КЭ обнаруживают по характерному цитопатогенному действию, идентифицируют прямым или непрямым методом флуоресцирующих антител. В культуре клеток куриного эмбриона методом флуоресцирующих антител осуществляют как идентификацию, так и индикацию вируса.
В наибольшей концентрации вирус КЭ накапливается в головном мозге новорожденных белых мышей, а также молодых мышей массой 6-8 г. Поэтому в случае выделения вируса на мышах из мозга заболевших животных (II-III пассаж вируса) готовят антиген на боратно-солевом растворе, рН 0,9, для идентификации вируса в РСК. Мозг заболевших мышей можно использовать в качестве антигена для реакции торможения гемагглютинации и в реакции нейтрализации.
Прямой и непрямой методы флуоресцирующих антител позволяют осуществлять экспресс-индикацию вируса КЭ в инфицированных культурах клеток. В первом случае клетки, зафиксированные в ацетоне, обрабатывают гаммаглобулиновой фракцией иммунной сыворотки к вирусу КЭ, меченной изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ), во втором - специфической иммунной сывороткой, содержащей антитела к вирусу КЭ, и затем соответствующей антивидовой сывороткой, меченной ФИТЦ.
Меченые коммерческие антивидовые сыворотки доступны для приобретения. Ниже дано описание этой модификации метода. Вируссодержащим материалом в разведении 1:10 - 1:50 заражают культуры клеток СПЭВ или куриных эмбрионов, выращенные на покровных стеклах, в пробирках или пенициллиновых флаконах. Выявление вирусного антигена проводят на 2 сутки 2-го пассажа после заражения. Для этого пинцетом вынимают 4-6 покровных стекол из пробирок с зараженной и контрольной культурой, споласкивают их физиологическим раствором, высушивают и фиксируют охлажденным ацетоном 15 минут. Затем на клетки наносят по капле разведенной 1:10 иммунной асцитической жидкости или сыворотки, содержащей антитела к вирусу КЭ, и препараты инкубируют во влажной камере при +37°С в течение 1 часа. После тщательной отмывки препаратов от несвязавшейся сыворотки физиологическим раствором их высушивают, на клетки наносят смесь 1:1 соответствующего антивидового гамма-глобулина (против глобулинов мыши, другого лабораторного животного или человека), меченного ФИТЦ, и бычьего альбумина, меченного родамином сульфафторидом, в рабочих разведениях, указанных на этикетках. Родамин сульфафторид используют для окраски нормальных клеток с целью контрастирования специфического свечения ФИТЦ, связанного с антигеном вируса. Препараты вновь инкубируют во влажной камере (+37°, 30 минут), отмывают физиологическим раствором и просматривают под люминесцентным микроскопом. В цитоплазме клеток, содержащих антиген вируса КЭ, обнаруживается характерное зеленое свечение. Нормальные клетки имеют неяркую оранжевую или коричневую окраску.
Выделение вируса от больного является одним из важных дифференциальных признаков при диагностике случаев КЭ. При обследовании материала от умерших в раннем периоде болезни, когда нет возможности выявить динамику специфических антител, выделение возбудителя остается единственным методом диагностики. Отрицательный результат вирусологического обследования не исключает диагноза, так как успех во многом зависит от того, в какой стадии заболевания получен материал для выделения вируса, а также от правильной обработки материала после сбора и соблюдения условий пересылки его в лабораторию. Длительность периода вирусемии не превышает 7 дней от начала заболевания. При обследовании в первые 4 дня частота выделения вируса из крови и спинно-мозговой жидкости может равняться 12-40%.
Необходимое для исследования время:
а) при вирусологическом исследовании в культуре ткани с индикацией вируса методом МФА - 7 дней, методом заражения новорожденных мышей - 14 дней;
б) при серологическом исследовании при наличии всех необходимых ингредиентов результаты исследования получают через 24 часа.
Определение вирусофорности клещей и частота выделения вируса от животных являются важными элементами эпидемиологической характеристики природных очагов и используются для прогнозирования заболеваемости КЭ, а также при определении эффективности истребительных мероприятий.
Для проведения вирусологического исследования клещей следует также руководствоваться методическими рекомендациями "Вирусологическое исследование отдельных экземпляров иксодовых клещей с использованием методов микроанализа", утвержденными Главным санитарно-эпидемиологическим управлением Министерства здравоохранения СССР 11.08.86 N 4135-86.