Дифференциальные тесты | Виды микобактерий комплекса М. tuberculosis | |||
М. tuberculosis | М. bovis | М. africanum | М. microti | |
Основные биохимические тесты на наличие: | ||||
Никотиновой кислоты | + | - | +/ - | +/ - |
Нитратредуктазы | + | - | - | - |
Термостабильной каталазы | - | - | - | - /+ |
Рост на среде с натрием салициловокислым (1000 мкг/мл) | - | - | - | - |
Дополнительные тесты: рост на средах, содержащих: | ||||
Пиразинамид | + | - | + | + |
Мочевина | +/- | +/ - | + | +/ - |
Гидролиз твина в течение 10 дней | - /+ | - /+ | - | - /+ |
ТСН (2 мкг/мл) | + | - | +/ - | +/ - |
5.2.1. Ниациновый тест
Ниацин (производное никотиновой кислоты) играет чрезвычайно важную роль в осуществлении всех окислительно-восстановительных реакций, происходящих в клетках кислотоустойчивых микобактерий. Ниацин продуцируют все микобактерий, однако исследования показали, что у М. tuberculosis в результате блокирования ряда метаболических путей никотиновая кислота накапливается в больших количествах, во много раз превышающих ее содержание в клетках микобактерий других видов. Ниацинотрицательные штаммы М. tuberculosis встречаются чрезвычайно редко. В то же время ниациновый тест не должен использоваться как единственный для идентификации М. tuberculosis, так как отдельные штаммы М. bovis, в том числе и субштаммы BCG, а также некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (М. simiae, M. chelonae chemovar niacinogenes) обладают относительно высокой способностью синтезировать ниацин и давать положительную реакцию. Это указывает на необходимость при дифференциации выделенных микобактерий не ограничиваться только ниациновой пробой, а использовать весь рекомендованный выше комплекс реакций.
Принцип метода. Ниациновая проба основана на том, что продуцируемая микобактериями никотиновая кислота, вступая в реакцию с цианистыми соединениями, дает ярко-желтое окрашивание. Наибольшее количество никотиновой кислоты обнаруживается у штаммов, выращенных на среде Левенштейна-Иенсена, поэтому именно эта среда используется для проведения ниациновой пробы. Подлежащая дифференциации культура микобактерий должна быть выращена на среде Левенштейна-Йенсена в течение не менее 3-4 недель и должна иметь достаточно массивный (не менее 50 колоний) рост.
При отрицательном результате реакции следует повторить ее после 6 или более недель инкубации посева, так как возможно, что молодая культура микобактерий не выделила достаточное для реакции количество никотиновой кислоты.
При постановке ниациновой пробы необходимо иметь в виду, что М. tuberculosis выделяют продуцируемую ими никотиновую кислоту в питательную среду, на которой они выращиваются. В связи с этим при наличии на поверхности косяка с питательной средой сливного роста микобактерий возможен ложноотрицательный результат реакции, так как экстрагирующий ниацин реактив не всегда может проникнуть в глубь питательной среды. Для облегчения проникновения экстрагирующего реактива в питательную среду необходимо при наличии на ее поверхности сливного роста микобактерий либо снять и удалить часть колоний, либо проколоть поверхность культуры.
Реакция требует свободного доступа кислорода на протяжении всего исследования, поэтому следует пользоваться либо ватно-марлевыми пробками, либо специальными металлическими колпачками, обеспечивающими свободный доступ воздуха в пробирку.
Ниациновый тест можно выполнять либо с растворами химических реактивов, приготавливаемыми непосредственно перед постановкой пробы, либо с заранее приготовленными в лабораторных условиях или коммерческими бумажными полосками.
Ниациновый тест с растворами химических реактивов требует соблюдения максимальной осторожности, так как цианистые соединения чрезвычайно токсичны при ингаляции паров и вызывают слезотечение, а анилин обладает онкогенным воздействием и способен проникать через кожный барьер. Пробу следует проводить только в вытяжном шкафу! Эти обстоятельства ограничивают применение ниациновой пробы с растворами химических реактивов.
В большинстве бактериологических лабораторий для постановки ниациновой пробы пользуются специально приготовленными бумажными полосками. Преимущество этого метода заключается в использовании вместо цианистых соединений роданистого калия - вещества более безопасного и доступного для бактериологических лабораторий, а также в быстроте реакции, позволяющей через 3-4 часа получить ответ о принадлежности выделенной на плотной питательной среде культуры к микобактериям человеческого вида или к другим микобактериям.
Следует иметь в виду, что из-за нестабильности растворов и реагентов необходимо строго соблюдать правила хранения и сроки использования как растворов и реагентов, так и бумажных полосок. В сомнительных случаях реагенты и полоски должны сравниваться со свежеприготовленными.
Реактивы для пропитывания бумажных полосок:
Раствор 1. 20% раствор ПАСК (парааминосалициловой кислоты)
В пробирку с 1,75 мл 96° этанола добавляют 0,25 мл диметилсульфоксида и 400 мг ПАСК.
Смесь подогревают на водяной бане при 56°С в течение 5-10 минут при периодическом встряхивании до полного растворения ПАСК.
Раствор 2. 60% раствор роданистого калия. Навеску 1,5 г роданистого калия растворяют в пробирке с 2,5 мл 8% раствора лимонной кислоты (200 мг лимонной кислоты и 2,5 мл дистиллированной воды).
Раствор 3. 50% раствор хлорамина "Б" 3,125 г хлорамина "Б" растворяют в 6,25 мл дистиллированной воды наводяной бане при температуре 56 - 60°С при периодическом встряхивании.
Индикаторные бумажные полоски размером 60x80 мм готовят из фильтровальной бумаги Filtrak 11 или аналогичной. Один конец полоски отмечают простым карандашом. Оттянутыми пастеровскими пипетками на полоски наносят по 1 капле свежеприготовленных растворов в следующем порядке:
- 20% раствор ПАСК - на отмеченный карандашом конец полоски;
- 60% раствор роданистого калия - на середину полоски;
- 50% горячий раствор хлорамина "Б" - на свободный конец полоски.
- Между каплями должны оставаться сухие промежутки.
Индикаторные полоски высушивают в темноте при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем для получения более четких результатов наносят повторно 1 каплю хлорамина "Б" на уже высохшую каплю этого раствора. Полоски вновь высушивают, затем помещают в пробирки, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике. Полоски пригодны к употреблению в течение 3 месяцев.
Процедура исследования
- Добавить в пробирку с исследуемой культурой микобактерий 1 - 1,5 мл стерильной дистиллированной воды. При наличии сливного роста проткнуть поверхность среды в нескольких местах пипеткой для облегчения доступа раствора к питательной среде;