О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации (с изменениями на 5 июня 2017 года)

IV. Культуральные методы исследования микобактерий комплекса М. Tuberculosis

Поступивший в лабораторию материал перед обработкой и посевом должен быть зарегистрирован в лабораторном регистрационном журнале. Каждой пробе материала необходимо присвоить порядковый регистрационный лабораторный номер, который должен использоваться при всех последующих лабораторных исследованиях.

4.1. Принципы предпосевной обработки диагностического материала

Обычные микробиологические методики для выделения чистых культур возбудителей не могут быть использованы при проведении бактериологических исследований на туберкулез. Это объясняется тем, что микобактерии туберкулеза очень требовательны к составу питательной среды. Их рост происходит очень медленно и зависит от соблюдения ряда условий. Колонии микобактерий, видимые невооруженным глазом, появляются через 3-6 недель. В связи с этим во избежание высыхания питательной среды для посевов обычно применяют бактериологические пробирки с герметичными пробками (резиновые, силиконовые) или производят парафинирование ватно-марлевых пробок.

Большинство проб клинического материала, поступающего в микробиологическую лабораторию для культурального исследования на туберкулез, в различной степени загрязнены быстрорастущими бактериями, бурный рост которых на богатых питательных средах мешает развитию микобактерий и затрудняет их выделение. Поэтому перед посевом на питательную среду диагностический материал подвергают специальной обработке, обеспечивающей деконтаминацию (обеззараживание), то есть гибель гноеродной и гнилостной микрофлоры.

Микобактерии туберкулеза, выделяющиеся из дыхательных путей больного, как правило, окружены большим количеством слизистых веществ, затрудняющих их выделение. В связи с этим мокроту и другие сходные материалы перед посевом подвергают разжижению и гомогенизации.

Все препараты, используемые в настоящее время для разжижения и деконтаминации диагностического материала, обладают более или менее выраженной токсичностью в отношении микобактерий. Чтобы обеспечить выживание достаточной части микобактериальной популяции, необходимо использовать щадящие методы обработки, позволяющие, с одной стороны, подавить быстрорастущие гноеродные и гнилостные микроорганизмы, а с другой - максимально сохранить жизнеспособность присутствующих в материале микобактерий.

Частота контаминации посевов в лабораториях, проводящих исследование свежесобранных проб, при культивировании мокроты на плотных яичных средах обычно составляет 2-3%. Если клинический материал до поступления в лабораторию хранится в течение нескольких дней в нерегламентированных условиях, частота контаминации может достигать 5% и более, что недопустимо. Контаминация менее 2% свидетельствует о нарушениях режима обработки материала. Для унификации результатов исследования необходимо, чтобы микробиологические лаборатории использовали для гомогенизации и деконтаминации диагностического материала один из стандартных методов, изложенных ниже.

4.1.1. Стандартные методы разжижения и деконтаминации

Перед посевом исследуемый материал необходимо гомогенизировать и освободить от сопутствующей гноеродной и гнилостной микрофлоры. Для этого мокроту, экссудаты и другой негомогенный материал собирают в стерильные флаконы со стеклянными бусами или битым стеклом, добавляют щелочь или кислоту и подвергают встряхиванию.

Все процедуры по переносу материала из одной посуды в другую при обработке и посеве производятся только стерильными пипетками. Запрещается перенос материала путем переливания его через край флаконов, пробирок и пр.

Жидкие материалы предварительно центрифугируют и обработке подвергают только осадок.

Все реактивы, используемые при приготовлении растворов для обработки диагностических материалов, должны иметь степень очистки не менее категории "химически чистый" (ХЧ). Могут использоваться как отечественные, так и импортные реактивы, имеющие степень очистки не менее чем "химически чистый".

Для предпосевной обработки диагностического материала рекомендуется использовать следующие методы и детергенты.

4.1.1.1 Обработка материала 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия

Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (NaPO) хорошо подавляет сопутствующую флору и даже при 2-3-дневном хранении материала при +4°С не повреждает микобактерии и мало влияет на их способность к росту на питательных средах.

1. Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе с 6-8 стеклянными бусинами или битым стеклом, залить равным объемом 10% трехзамещенного фосфата натрия и поместить на 10 мин во встряхиватель.

2. Флакон с материалом поместить на 18 - 20 часов в термостат при 37°С.

3. После этого материал стерильной пипеткой объемом 5 - 10 мл перенести в пробирки, уравновесить их и центрифугировать при 3000 х g* в течение 15 минут. При указанном режиме происходит осаждение 95% присутствующих в материале микобактерий.

________________

* Ускорение центрифугирования ("относительная сила центрифугирования" (ОСЦ)) измеряется в относительных единицах к ускорению свободного падения "g". Формула расчета ОСЦ:

ОСЦ=1,12 Rmax (об/мин / 1000), где Rmax - максимальный радиус от центра вращения ротора до дна пробирки в мм.

Например, при R=180 мм и 1500 об/мин (центрифуга ЦЛ1-3) ОСЦ=450 g. При увеличении частоты вращения до 3000 об/мин ОСЦ возрастает до 1800 g.

Необходимое число оборотов в мин можно рассчитать по формуле:

Об.мин = 1000 (ОСЦ/(1,12 Rmax))

4. Надосадочную жидкость отобрать стерильной пипеткой на 10-5 мл и перенести ее в емкость с дезинфицирующим раствором, оставив в каждой пробирке 1,2-1,5 мл осадка.

5. Использованную пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим раствором.