Для окраски мазков, приготовленных непосредственно из диагностического материала (метод прямой микроскопии), наиболее часто используется метод Ziehl-Neelsen. Однако при большом количестве исследуемых ежедневно мазков в целях ускорения процедуры микроскопии практикуется использование люминесцентной микроскопии.
10.1. Окраска препаратов для световой микроскопии по методу Ziehl-Neelsen
Метод окраски по Ziehl-Neelsen является наиболее употребляемым и распространенным методом для выявления кислотоустойчивых микобактерий. Он основан на использовании нескольких специальных методических приемов:
- окраска фуксином (с подогреванием) - при одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего действия карболовой кислоты повышается способность красителя проникать в микробную клетку и особенно в структуры ее клеточной стенки, состоящей из липидов, миколовых кислот и восков. Обычные анилиновые красители не проникают в клеточную стенку микобактерий, и последние не окрашиваются;
- обесцвечивание (3 мин) - последующая обработка мазка 25% раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта приводит к обесцвечиванию красителя, проникшего в структуры, не обладающие достаточной гидрофобностью и стойкостью к разрушению в кислоте (кислотоустойчивостью). Только кислото- и спиртоустойчивые микроорганизмы стойко удерживают краситель и остаются после обесцвечивания окрашенными в малиново-красный цвет;
- контрастирующая окраска (1 мин) - обесцвеченные элементы мазка докрашивают метиленовым синим для придания контрастности препарату.
10.2. Оборудование и реактивы для окраски по методу Ziehl-Neelsen
Для окраски мазков по методу Ziehl-Neelsen необходимы:
- раковина или специальный вместительный лоток для окраски;
- специальный штатив ("рельсы") для окраски мазков на предметных стеклах;
- пинцет или щипцы для взятия предметных стекол с мазками;
- газовая или спиртовая горелка для фиксации препарата (если мазки не фиксированы в сушильном шкафу) и подогревания его при окрашивании карболовым фуксином;
- металлический стержень для приготовления ватного тампона, который используется вместо горелки для подогревания препарата при окрашивании карболовым фуксином;
- фильтровальная бумага размером ~ 4 х 1,5 см для окраски мазков карболовым фуксином; раствор карболового фуксина;
- 25% раствор серной кислоты или 3% раствор солянокислого спирта;
- дистиллированная вода для промывания мазков;
- 0,3% раствор хлорида метиленового синего;
- штатив для просушивания окрашенных стекол на воздухе в вертикальном или наклонном положении.
Реактивы:
- спирт этиловый 96° марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;
- кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;
- кислота серная концентрированная, ГОСТ 4204-77;
- фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;
- фуксин основной, ТУ 6-09-3804-82;
- метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;
- глицерин, ЧДА, ГОСТ 6259-75;
- вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.
Приготовление растворов: