Об усилении мероприятий по профилактике туляремии

____________________________________________________________________

Взамен настоящих методических указаний "Лабораторная диагностика туляремии" с 9 сентября 2005 года введены МУ 3.1.2007-05 "Эпидемиологический надзор за туляремией" .

- Примечание изготовителя базы данных.

____________________________________________________________________

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ТУЛЯРЕМИИ

(Методические указания)

Лабораторная диагностика туляремии у людей основывается, главным образом, на иммунологических методах (серо-аллергическая диагностика) и в меньшей степени на бактериологических методах. В методические указания включены методы лабораторной диагностики, позволяющие быстро и надежно выявлять это заболевание у человека и обеспеченные диагностическими препаратами, а также некоторые перспективные методы и приемы, находящиеся на стадии внедрения в практику.

1. Аллергические методы

В патогенезе туляремийной инфекции значительную роль играет развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), выявление которой может служить методом аллергической диагностики туляремии. Метод основан на особенностях организма человека, заболевшего или переболевшего туляремией, отвечать местной аллергической реакцией, в виде гиперемии и инфильтрата, на введение туляремийного антигена (тулярина). У больных туляремией людей кожная аллергическая реакция становится положительной обычно с 3-5 суток болезни, реже - в более поздние сроки, и сохраняется многие годы, благодаря чему аллергический метод служит для ранней или ретроспективной диагностики, являясь при этом строго специфичным. У привитых живой вакциной также возникает аллергическая реактивность, но она развивается медленнее (через 10-15 дней после вакцинации). Аллергический ответ у вакцинированных сохраняется 5-6 лет, иногда дольше, и может служить методом определения сохранности поствакцинального иммунитета. Кожную аллергическую реакцию выполняют как накожно, так и внутрикожно с соответствующим тулярином. Следует помнить, что аллергическая реакция на введение антигена - это общая реакция организма, которая при развившемся инфекционном процессе может вызвать ухудшение состояния больного, а местная реакция иногда сопровождается некрозом. Поэтому в качестве диагностического приема у больных людей проба с тулярином должна применяться с осторожностью.

1.1. Внутрикожная проба с тулярином. Для внутрикожной пробы применяют внутрикожный тулярин - взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма, убитых нагреванием при 70 град.с в течение 1 часа. Взвесь готовят на физиологическом растворе, содержащем 3% глицерина. В 1 мл препарата содержится 500 млн. убитых бактерий. Выпускают препарат в запаянных ампулах, содержащих 1 мл препарата (или 10 человеко-доз). Препарат предназначен в первую очередь для диагностики туляремии.

Техника постановки реакции. Тулярин в количестве 0,1 мл вводят стерильным шприцем строго внутрь кожи левого предплечья (на границе верхней и средней трети). Кожу предварительно обрабатывают спиртом и эфиром. На месте введения препарата образуется беловатый пузырек диаметром 3-4 мм, который примерно через 30 минут рассасывается.

Учет и оценка реакции. Учет реакции производят через 24-48 часов путeм осмотра и ощупывания участка кожи, куда был введен тулярин. При положительной реакции на месте введения тулярина уже через 6-10 час обнаруживаются покраснение (гиперемия) и отек (инфильтрат). Через 24 часа реакция кожи выражена вполне отчетливо и имеет вид гиперемированного, нередко болезненного инфильтрата. Реакцию считают положительной при наличии инфильтрата и гиперемии диаметром не менее 0,5 см. Интенсивность реакции определяют по величине реагирующего участка (отека и гиперемии) кожи, который измеряют в сантиметрах в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Изменения кожи в виде гиперемии без инфильтрата, исчезающие через 48 часов, расценивают как отрицательный результат. В сомнительных и подозрительных случаях возможна повторная постановка реакции, так как отрицательный результат мог быть обусловлен ранним сроком от начала заболевания. Так, аллергическая реакция может запаздывать при тяжелых формах инфекции. Запаздывание реакции может также иметь место при раннем применении антибиотиков для лечения больного. В ряде случаев аллергическая реакция сопровождается образованием пустулы или кратковременным лимфангоитом с незначительным увеличением регионарных лимфатических узлов и повышением температуры тела на 1-1,5 град.С в течение 1-2 дней. Известны редкие случаи образования некроза на месте инъекции тулярина. В этой связи для диагностики туляремии предпочтительнее использовать аллергические методы in vitro или серологические методы.

1.2. Накожная проба с тулярином. Для накожной пробы применяют накожный тулярин - взвесь туляремийных бактерий вакцинного штамма, убитых нагреванием при 70 град.С в течение 1 часа. Взвесь готовят в физиологическом растворе, содержащем 3% глицерина. В 1 мл препарата содержится 10 млрд. убитых бактерий. Выпускают препарат в запаянных ампулах, содержащих 1 мл, что составляет 20 человеко-доз. Препарат предназначен в первую очередь для определения иммунитета у привитых против туляремии или для анамнестического обследования.

Техника постановки реакции. Перед употреблением ампулу с накожным тулярином встряхивают до образования равномерной взвеси. Одну каплю тулярина глазной пипеткой наносят на обработанную спиртом и эфиром кожу наружной поверхности левого плеча в его средней трети. Через каплю стерильным скарификатором делают две параллельные насечки длиной 8-10 мм, соблюдая расстояние между насечками 5 мм, до появления росинок крови. Затем тулярин тщательно втирают в насечки плоской стороной скарификатора в течение 1 мин. Тулярин применяют немедленно после вскрытия ампулы.

Учет и оценка реакции. Учет реакции производят через 48-72 часа. Положительная реакция выражается отечностью кожи вокруг насечек и краснотой, которые иногда появляются уже через 24 часа после введения тулярина, через 48-72 часа реакция ярко выражена и далее постепенно угасает, полностью исчезая к 7-10 дню. Диаметр реагирующего участка достигает 1-2 см. В редких случаях по ходу насечек появляются везикулы, исчезающие через 2-3 дня. Реакцию считают положительной при величине реагирующего участка кожи не менее 0,5 см и наличии вдоль насечек ясного покраснения и небольшой отечности (валик). При правильной технике постановки накожная туляриновая проба по чувствительности не уступает внутрикожной, но в отличие от последней не сопровождается повышенными местными или общими реакциями. Категорически запрещается накожный тулярин вводить внутрикожно или подкожно, так как он может вызвать бурную местную и общую реакции.

1.3. Реакция лейкоцитолиза (РЛ). Аллергические методы диагностики in vivo (накожная и внутрикожная туляриновые пробы) просты в исполнении и до настоящего времени используются на практике. Вместе с тем введение даже убитого антигенного препарата небезразлично для организма обследуемого. В этой связи заслуживает внимания эффективный метод выявления и оценки гиперчувствительности методом in vitro с помощью альтерации лейкоцитов - реакции лейкоцитолиза (Суханов с соавторами). РЛ основана на учете разрушения лейкоцитов сенсибилизированного организма под влиянием специфического аллергена (антигена), регистрируемого методом in vitro. Реакция лизиса лейкоцитов становится положительной уже в первые дни после вакцинации или заболевания (3-4 день), удерживается в течение многих лет (у переболевших - до 40 лет). На 7-15 день после вакцинации показатели лизиса лейкоцитов составляют в среднем 49-50%, затем постепенно снижаются, но даже через 1-5 лет после вакцинации оставались на достаточно высоком уровне (30-31%). РЛ обладает строгой специфичностью, дает возможность количественного учета степени сенсибилизации организма, позволяет получить ответ через несколько часов после взятия крови, осуществляется in vitro, т.е. без введения в организм специфического аллергена.

Техника постановки РЛ. В 2 лунки полистироловой пластины вносят по 50 мкл 10% раствора цитрата натрия, затем в первую (опытную) лунку добавляют 50 мкл антигена (накожного тулярина, содержащего 1,10(10) бактерий в 1 мл), а во вторую (контрольную) - 50 мкл физиологического раствора. Таким образом, в обеих лунках конечная концентрация цитрата натрия составляет 5%. Кровь для исследования берут из пальца руки и в количестве 100 мкл вносят в каждую из двух лунок. Пластинку закрывают и помещают на 2 часа в термостат при температуре 37 град.С. Кровь в лунках тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Затем по 20 мкл крови из обеих лунок поочередно забирают с помощью микропипеточного дозатора и переносят в соответствующие лунки планшета для макроагглютинации, содержащие 0,4 мл 3%-ной уксусной кислоты, подкрашенной до светло-голубого цвета с помощью метиленовой синьки.

Учет и оценка РЛ. Количество лейкоцитов подсчитывают в крови из обеих лунок в камере Горяева. Разрушенные клетки, а также клетки, собирающиеся в кучки, не учитывают. Коэффициент лейкоцитолиза вычисляют по формуле

Мк-Мо
К%= ------ х100
Мк

где Мо - количество лейкоцитов в опыте (первая лунка);

Мк - количество лейкоцитов в контроле (вторая лунка).

Для оценки результатов используют следующую шкалу показателей:

К = 15% - отрицательный или сомнительный результат;

К = 16-20% - слабо положительный результат;

К = 21-30% - положительный результат:

К = 31 % и выше - резко положительный результат.

2. Серологические методы

2.1. Реакция агглютинации. Наиболее распространенным и вместе с тем вполне точным методом серологической диагностики туляремии является реакция агглютинации (РА). Реакция служит для установления диагноза у больного или переболевшего (ретроспективный диагноз) и может быть использована при изучении иммунологического состояния привитых против туляремии. Обнаружение агглютининов у больного туляремией обычно отмечается через 10-15 дней, при этом агглютинационный титр сыворотки в этот период составляет 1:50-1:100, но далее быстро нарастает и на 4-6 неделе болезни достигает 1:400-1:800, реже 1:1600 и выше. По достижении максимальных показателей агглютинационный титр сыворотки затем медленно снижается и через 6-12 месяцев составляет 1:100-1:400, позднее падает до 1:10-1:50 и на этом уровне может удерживаться в течение многих лет. Длительность сохранения агглютининов делает возможныя использование РА для ретроспективного диагноза. У привитых против туляремии агглютинины обнаруживаются через 2-3 недели, достигают через 4-6 недель максимальных титров 1:160-1:320, реже выше, затем снижаются до 1:10-1:40 и обычно выявляются в течение 5-7 лет после вакцинации (иногда дольше).