Приложение 19
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 9 января 1998 года N 2
ИНСТРУКЦИЯ
по изготовлению консервированных стандартных
эритроцитов и их применению в изосерологических
исследованиях
Стандартные эритроциты, содержащие определенные сочетания аллоантигенов, предназначенны для выявления антиэритроцитарных антител в сыворотке исследуемой крови, при определении групп крови АВО перекрестным способом, при определении резус-принадлежности крови, а также для проведения контроля специфичности и активности стандартных изогемагглютинирующих сывороток АВО, сывороток антирезус, тест-сывороток и реактивов, предназначенных для определения антигенов различных систем эритроцитов крови человека. Стандартные эритроциты группы O(I) должны содержать в эритроцитах клинически значимые антигены: D, С, C_w, с, Е, е, K, k, Fy, Jk, M, N, S, s, Le.
С целью увеличения срока годности стандартных эритроцитов можно производить их консервирование специально изготовленными консервирующими растворами.
1. Требования, предъявляемые к стандартным
эритроцитам
Стандартные эритроциты для исследований по системе АВО должны давать четкую, хорошо видимую агглютинацию при взаимодействии со стандартными сыворотками соответствующей специфичности и не давать агглютинации с сыворотками, не содержащими антител против данного антигена эритроцитов.
Стандартные эритроциты группы А(II), предназначенные для выявления агглютинина анти-А, должны иметь титр не ниже 1:64, эритроциты группы В(III), предназначенные для выявления агглютинина анти-В, также должны иметь титр не ниже 1:64.
Титр антигенов А и В устанавливается с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток группы А(бета)(II) (анти-В) и В(альфа)(III) (анти-А), или соответствующих моноклональных антител, удовлетворяющих требованиям действующих инструкций.
Время наступления агглютинации эритроцитов А(1) и В со стандартными изогемагглютинирующими реактивами должно составлять не более десяти секунд; эритроцитов подгруппы А(3), В(2) - не более двух минут.
Стандартные эритроциты группы крови O(I) не должны давать агглютинации со стандартными сыворотками групп крови 0(альфа бета)(I), А(бета)(II), В(альфа)(III) в течение двадцати минут.
Стандартные резус-положительные эритроциты группы крови O(I), содержащие антиген D, а также антигены C, C_w, с и Е, в различных сочетаниях, предназначенные для выявления антител системы резус, должны давать соответственно со стандартными сыворотками анти-D, анти-С, анти-С_w, анти-с, анти-Е и анти-е четкую агглютинацию при определении методом конглютинации с желатином, экспресс-методом в пробирках или на плоскости без подогрева или непрямой пробе Кумбса в зависимости от того, для какого метода исследования предназначена данная стандартная сыворотка антирезус.
Стандартные резус-отрицательные эритроциты O(I) фенотипа ccddee не должны давать агглютинации с реактивами антирезус, содержащими антитела анти-D, анти-С, анти-Е во всех методах исследования, для использования в которых предназначены указанные реактивы антирезус.
Время наблюдения за отрицательной реакцией должно соответствовать времени, установленному для каждой из этих реакций.
II. Приготовление консервированных стандартных
эритроцитов
Приготовление стандартных эритроцитов в условиях строгого соблюдения асептики и состоит из изготовления консервирующего раствора, получения взвеси эритроцитов в консервирующем растворе, розлива эритроцитов, маркировки продукции и контрольных исследований.
1. Изготовление консервирующего раствора для
стандартных эритроцитов
Консервирующей средой для приготовления стандартных эритроцитов могут служить растворы следующего состава:
Консервант N 1
сорбит 40,0 г
глюкоза 6,0 г
Na(2)HPO(4)12H(2)O 2,0 г
KH(2)PO(4) 0,9 г
левомицетин 0,06 г
этиловый спирт 96 град. 100 мл
вода бидистиллированная до 1000 мл
pH раствора 6,8 - 6,9
В случае необходимости доведения pH до требуемой величины добавляется несколько кристаллов аскорбиновой кислоты или Na(2)HPO(4)12H(2)O.
Консервант N 2
аденин 0,03 г
инозин 0,06 г
лимонная кислота 1,5 г
глюкоза 3,0 г
Na(3)PO(4) 0,4 г
NaOH 1 н 20 мл
вода дистиллированная до 100 мл
pH раствора 6,3 - 6,4
Консервирующие растворы (консерванты) представляют собой прозрачную бесцветную жидкость без запаха. Стерилизация консервантов производится путем фильтрования их через соответствующие стерилизующие фильтры. Розлив производят в стерильные флаконы емкостью 250 мл или 500 мл, которые немедленно закрывают резиновыми пробками и завальцовывают металлическими колпачками. Срок годности консервантов - шесть месяцев. В случае помутнения консервирующего раствора или появления желтого окрашивания применение его для работы недопустимо.
2. Получение взвеси эритроцитов в
консерванте
Источником получения стандартных эритроцитов является эритроцитная масса, получаемая после удаления плазмы из консервированной крови донора. Кровь берут от доноров, фенотип эритроцитов которых заранее определен. Для получения стандартных эритроцитов, содержащих антигены системы АВО, в качестве исходного материала должна быть использована эритроцитная масса от одного специально отобранного донора.
А для получения стандартных эритроцитов других систем можно использовать смесь эритроцитов группы O(I) от нескольких (2-4) доноров различного фенотипа таким образом, чтобы каждый из редких антигенов: K, C_w, Е присутствовали в эритроцитах не менее чем у двух доноров. Используется эритроцитная масса, полученная не позднее 2-3 суток от момента заготовки крови.
В боксе через стерильную систему путем прокола переливают эритроцитную массу во флакон с заготовленным консервантом так, чтобы соотношение эритромассы и консерванта было 1:4. Содержимое флакона осторожно перемешивают и разливают той же системой в стерильные флаконы по 5, 10 или 25 мл. Используют обычную систему для взятия.
Флаконы (по 5, 10 или 25 мл) закрывают резиновыми пробками, завальцовывают металлическими колпачками, немедленно маркируют (см.п.3) и помещают в рефрижератор при температуре + 4 град.С.