Приложение 11
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 9 января 1998 года N 2
ИНСТРУКЦИЯ
по исследованию сыворотки на наличие резус-антител
I. Введение
Резус-антитела относятся к так называемым аллоиммунным антителам, они не являются нормальным свойством сыворотки человека, а появляются в крови резус-отрицательных людей лишь при особых условиях.
Условиями, способствующими образованию резус-антител, являются введение резус-отрицательному человеку резус-положительной крови или беременность резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом.
Определение резус-антител наряду с определением резус-принадлежности больного и донора необходимо для предупреждения переливания резус-несовместимой крови, а также для диагностики возможного заболевания плода или новорожденного гемолитической болезнью.
Определение резус-антител требуется также при подготовке материала в целях использования для приготовления сыворотки антирезус.
Резус-антитела бывают разные по специфичности: анти-D, анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е; и по форме: полные и неполные.
Специфичность антител определяется тем, с каким из антигенов они реагируют. Форма антител определяется тем, каким образом они реагируют с эритроцитами, содержащими специфические для них резус-антигены.
Полные антитела, соединяясь с резус-антигенами эритроцитов, вызывают агглютинацию этих эритроцитов при реакции в солевой среде. Неполные антитела в этих условиях лишь соединяются с эритроцитами, но не вызывают агглютинации, так что внешне эта реакция ничем не проявляется.
Для того, чтобы установить, произошла ли реакция между неполными резус-антителами и эритроцитами, необходимы специальные условия, в частности, добавление различных коллоидов (желатин, полиглюкин), или использование сыворотки для пробы Кумбса, реагирующей с человеческим белком (непрямая проба Кумбса). При всех перечисленных условиях реакция между резус-антителами и эритроцитами, содержащими резус-антиген, в конечном итоге также проявляется в виде агглютинации эритроцитов.
Разные методы определения резус-антител требуют различных оптимальных для них температурных условий.
II. Общие замечания
1. Учет специфичности антител. Специфичность
стандартных эритроцитов
Наиболее часто при иммунизации резус-отрицательных людей повторными трансфузиями крови или беременностями образуются антитела анти-D, но при этих же условиях могут образоваться и другие резус-антитела. Поэтому при определении антител в сыворотке крови человека эту сыворотку испытывают с резус-положительными эритроцитами, обязательно содержащими антигены резус: D, С, Е, с, е.
Если антигены С и Е в эритроцитах специально не определялись, то число резус-положительных образцов должно быть не менее 20 для того, чтобы среди них обязательно встретились все антигены резус.
В качестве контроля на специфичность реакции, а также для выявления антител анти-с и е в исследование включаются стандартные резус-отрицательные - ccddee эритроциты и, если возможно, собственные эритроциты лица, сыворотка которого испытывается.
Такое исследование является предварительным. Для уточнения специфичности требуются дополнительные специальные исследования (см. п.IX).
2. Учет формы антител
Чаще всего при иммунизации резус-антигеном образуются неполные антитела; иногда одновременно с ними образуются и полные. Кроме того, встречаются случаи, в которых у человека образуются только полные резус-антитела.
Поэтому определение резус-антител следует производить не менее чем двумя методами, одним из которых обязательно должен быть метод солевой агглютинации, выявляющий полные антитела, а другим - любой метод, выявляющий неполные антитела.
III. О выборе метода выявления резус-антител
Ниже в п.III, IV, V, VI описаны различные методы исследования сывороток. Из них непрямая проба Кумбса (см.III), реакция с применением желатина (см.IV) и реакция с применением полиглюкина (см.V) выявляют неполные резус-антитела, и для этой цели может быть использован любой из них.
Метод исследования сыворотки в солевой среде (см.VI) выявляет полные резус-антитела и должен обязательно использоваться одновременно с любым из упомянутых выше.
IV. Исследование сыворотки на наличие
неполных резус-антител непрямой
пробой Кумбса
1. Предварительная обработка стандартных
эритроцитов
Кровь для приготовления эритроцитов берут в количестве 0,5-1 мл в обычные пробирки емкостью не менее 10 мл, содержащие 0,25 мл изотонического раствора лимоннокислого натрия. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. Пробирки доливают доверху изотоническим раствором NaCl, затем содержимое пробирок перемешивают, центрифугируют и отсасывают отмывную жидкость. Такое отмывание повторяют дважды. После отмывания на дне пробирки остаются отмытые эритроциты, которые и применяют для исследования сыворотки.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают и нумеруют пробирки высотой 4-10 см с внутренним диаметром 0,5-0,8 см (первые размеры удобнее). Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.
б. Во все пробирки вводят по три капли (0,15 мл) испытуемой сыворотки.
в. Со дна каждой пробирки, содержащей отмытые стандартные эритроциты, очень тонкой пастеровской пипеткой набирают маленькую каплю (0,01 мл) эритроцитов и переносят ее в пробирку с испытуемой сывороткой согласно нумерации пробирок.
г. Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания и помещают для инкубации в термостат на 45 мин. при температуре + 37 град.С. За это время резус-антитела, если они имеются в испытуемой сыворотке, фиксируются на эритроцитах.
д. После инкубации в пробирки доливают доверху изотонический раствор NaCl, содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют, после чего надосадочную жидкость отсасывают. Такое отмывание эритроцитов повторяют 3-4 раза.