Приложение 9
УТВЕРЖДЕНО
Приказ Минздрава России
от 09.01.98 N 2
ИНСТРУКЦИЯ*
по применению ЦОЛИКЛОНА анти-D
диагностического жидкого для определения D антигена системы резус
(Антитела моноклональныа анти-D)
ТУ 9398-215-27575295-95
----------------
* Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева, Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.
1. Назначение
ЦОЛИКЛОНА анти-D предназначен для выявления D антигена системы резус в эритроцитах человека и применяется в серологических тестах взамен или параллельно с изоиммунной анти-D сывороткой.
Порядок установления резус-принадлежности крови определен "Инструкцией по определению резус-принадлежности крови", утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации в 1997 году и Методическими рекомендациями по определению резус-принадлежности крови, утвержденными ГНЦ РАМН 27 апреля 1994 года.
2. Характеристика и основные свойства ЦОЛИКЛОНА Анти-D
Действующим началом ЦОЛИКЛОН Анти-D являются моноклональныа анти-D антитела, продуцируемые лимфобластоианой линией клеток человека, полученной из лимфоцитов донора, гипериммунного против D антигена. Антитела, продуцируемые клетками одного клона, являются моноклональными, принадлежат к одному классу иммуноглобулинов, полностью идентичны по структуре и биологической активности.
Поскольку линия клеток, секретирующих моноклональные анти-D антитела, получена из лимфоцитов здорового донора, исключена контаминация реагента патогенными вирусами (гепатит, СПИД и др.). Однако с исследуемыми образцами крови следует работать в перчатках во избежание заражения патогенными вирусами, передающимися через кровь.
ЦОЛИКЛОН Анти-D представляет собой неразбавленную или разведенную солевым раствором культуральную жидкость, кондиционированную клетками-продуцентами антител. Анти-D моноклональные антитела принадлежат к иммуноглобулинам класса G(IgGl). ЦОЛИКЛОН Анти-D не содержит антител иной специфичности и поэтому может быть использован для выявления D антигена в эритроцитах любой группы крови.
Анти-D антитела, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G (неполные антитела), не вызывают прямой агглютинации эритроцитов, содержащих D антиген, и могут быть использованы в реакции конглютинации с желатином, непрямом антиглобулиновом тесте (пробе Кумбса), в реакции агглютинации эритроцитов, обработанных протеолитическими ферментами, в том числе в автоматизированных системах типа "Группоматик".
3. Техника определения D-антигена системы резус
Определение D-антигена производится в нативной крови, стабилизированной с помощью применяемых консервантов; в крови, взятой без консерванта; в крови, взятой из пальца. Наиболее четкая реакция агглютинации наблюдается при использовании высокой концентрации эритроцитов. Заключение о присутствии D-антигена в исследуемых эритроцитах делают по наличию положительной реакции агглютинации.
3.1. Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса)
Является наиболее чувствительным методом выявления D антигена. Взвесь (2-3%) в физиологическом растворе трижды отмытых исследуемых эритроцитов помещают в круглодонную пробирку (0,1 мл взвеси эритроцитов) или 96-ячеечную круглодонную плату (0,05 мл/ячейку), добавляют равный объем ЦОЛИКЛОНА и инкубируют в течение 45-60 минут при 37 град.С. Затем после однократного отмывания физиологическим раствором к осадку эритроцитов добавляют 0,05-0,1 мл антиглобулиновой сыворотки, тщательно перемешивают и немедленно или через 15-30 минут инкубации при комнатной температуре центрифугируют при 200 g в течение 15-20 секунд. Осадок мягко взвешивают и по наличию агглютинатов, выявляемых макро- или микроскопически, делают заключение о присутствии D антигена в исследуемых эритроцитах.
3.2. Реакция конглютинации с желатином
В агглютинационную пробирку вносят одну каплю (0,05-0,1 мл) свободных эритроцитов из сгустка свернувшейся крови или эритроцитов, отмытых от консерванта. Затем добавляют две капли (0,1-0,2 мл) 10% раствора желатина, предварительно прогретого при 45-50 град.С до разжижения, и одну каплю ЦОЛИКЛОНА Анти-D. Суспензию тщательно перемешивают, инкубируют 10-15 минут в водяной бане или 30 минут в термостате при 48 град.С, прибавляют 5-6 мл физиологического раствора и после осторожного переворачивания пробирки визуально определяют наличие агглютинатов. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о присутствии в них D антигена.
3.3. Реакция с препаратом на основе полиглюкина
Полиглюкин практически всегда вызывает неспецифическую агглютинацию D-отрицательных эритроцитов, поэтому невозможно объективное заключение об отсутствии D антигена или о наличии его слабого варианта в исследуемых эритроцитах. В связи с этим использование полиглюкина для моноклональных антител не рекомендуется.
3.4. Реакция агглютинации с эритроцитами, обработанными
протеолитическими ферментами
ЦОЛИКЛОН Анти-D, содержащий моноклональные антитела класса IgG, способен вызывать прямую агглютинацию D-положительных эритроцитов, обработанных такими протеолитическими ферментами как бромелин, папаин и др., и поэтому может применяться в автоматических системах типирования крови.
3.5. Контроль специфичности реакции агглютинации
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо от применяемой методики исследования) необходимо использовать стандартные D-положительные и D-отрицательные эритроциты. Желательно также включение образцов со слабовыраженным D антигеном.
4. Форма выпуска
ЦОЛИКЛОН Анти-D выпускается в жидкой форме во флаконах объемом 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%.
Срок хранения - два года в холодильнике при 2-8 град. С. Вскрытый флакон можно хранить в холодильнике в течение одного месяца в закрытом виде.
5. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флаконов, получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения, номер серии, причины, по которым реагент признан негодным, протокол с результатами проверки реагента. Вместе с рекламацией направляют 2-3 невскрытых флакона данной серии.