МР N 01.038-08

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста

Методические рекомендации разработаны ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г.Москве" (Завьялов Н.В., Клочкова С.И., Скворцова Е.Л.), МГУ им.М.В.Ломоносова (Данилов В.С., Юдина Т.П.)

УТВЕРЖДАЮ

Главный врач ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Председатель Лабораторного Совета Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека А.И.Верещагин

"20" ноября 2008 г.

1. Область применения

Методические рекомендации содержат описание метода токсикологического тестирования парфюмерно-косметической (ПК) продукции с применением в качестве тест-объекта реактива люминесцентных бактерий "Эколюм" и определяют порядок проведения испытаний следующих видов ПК продукции жидкие пеномоющие средства (пена для ванн, гель для душа, жидкое туалетное мыло), шампуни для волос и тела; дезодоранты и депиляторы в аэрозольной упаковке, парфюмерные жидкости (туалетная и парфюмерная вода, духи, одеколон, лосьоны после бритья и пр.), водно-спиртовые, пропиленгликолевые экстракты, ароматические экстракты, масляные экстракты, жиросодержащие косметические средства (лосьоны, косметические эмульсии, косметическое молочко), кремы косметические, лаки маникюрные и средства для ухода за ногтями.

Методические рекомендации предназначены для скрининговой оценки вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой ПК продукции с учетом общетоксического и раздражающего действия.

Методика может быть применена в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.

Методические рекомендации предназначены для учреждений Государственной санитарно-эпидемиологической службы РФ, учреждений научно-исследовательского и практического профиля, осуществляющих разработку новых видов ПК продукции и контроль ее качества.

Результаты исследования качества ПК продукции учитывают при определении уровня их возможного прямого или косвенного влияния на здоровье человека.

2. Нормативные ссылки

1 Закон РСФСР "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 19 апреля 1991 г.

2 "Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании", утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации от 5 июня 1994 г. N 625

3 Руководство Р 1.1.001-96 "Общие требования к построению, изложению и оформлению нормативных и методических документов системы государственного санитарно-эпидемиологического нормирования"     

4 Руководство Р 1.1.003-96 "Общие требования к организации разработки нормативных и методических документов системы государственного санитарно-эпидемиологического нормирования"

5 ГОСТ Р 1.5-92 "Государственная система стандартизации Российской Федерации Общие требования построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов"

6 СанПиН 1.2.681-97 "Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-косметической продукции"

7 МУ 05 РЦ/3140 "Методические указания по проведению токсикологических исследований ингредиентов косметических средств в эксперименте на животных" 8 8* МР 11-1/131-09 "Определение токсичности химических соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста"

________________

* Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

3. Термины и определения

Экотоксикологический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением нормативов качества окружающей среды и предупреждения попадания токсических веществ в водные объекты.

Химическое загрязнение воды - изменение химического состава воды, возникшее под прямым или косвенным воздействием производственной деятельности и вызывающее снижение ее качества, и возможную опасность для здоровья населения.

Токсичность - степень проявления ядовитого действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность - один из важных факторов, определяющих качество воды, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности воды при ее использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе воды.

Критерий токсичности (индекс токсичности) - достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности воды. Среди тест-параметров наиболее часто используются выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и метаболической активности организмов.

Тест-реакция - это изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.

Биотестирование - проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов. Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.

Токсические эффекты, регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемой воде, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.

Биолюминесценция - интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.

4. Принцип методики

В качестве тест-объекта используются препараты "Эколюм" лиофилизированных люминесцентных бактерий или ферментные препараты бактериальной люциферазы. Методика основана на определении изменения интенсивности бактериальной биолюминесценции при воздействии химических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.

Критерием токсического действия является измерение с помощью прибора "Биотокс-10" интенсивности биолюминесценции тест-объекта под воздействием химических соединений, содержащихся в экстрактах ПК продукции по сравнению с раствором, не содержащей токсических веществ, или эталонной пробой. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

При изучении токсикологических свойств ПК продукции и ее химических ингредиентов люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на высшие животные, метод Драйзе, культуры клеток человека, подкожной адсорбции, фототоксичности и т.п.

5. Количественная оценка параметров тест-реакции

Токсическое действие исследуемой пробы определяется по ингибированию интенсивности ее биолюминесценции за 30-минутный (в экспрессном варианте - 5 минут) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины - индекса токсичности "Т" и функциональными токсикологическими параметрами ЕС20 и ЕС50.

Индекс токсичности "Т", равный отношению Т=100(Io-I)/Io, где Io и I соответственно интенсивность биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с бактериальным препаратом.

Методика допускает три пороговых уровня индекса токсичности:

1) допустимая степень токсичности образца индекс токсичности Т меньше 20,

2) образец токсичен индекс Т равен или больше 20 и меньше 50,

3) образец сильно токсичен индекс токсичности Т равен или более 50.

Токсикологические параметры пробы ЕС20 и ЕС50, определяемые также посредством измерения Io и I, позволяют быстро и экономно выяснить вопрос при каких объемах исходного слабо токсического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях сильно токсический образец станет безопасным (величины менее ЕС20).

ЕС50 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация), вызывающий тушение свечения биосенсора на 50% по сравнению с контролем. В этом случае образец сильно токсичен (индекс токсичности равен 50%). ЕС20 есть эффективный объем образца, (в опытах с чистым химическим соединением - концентрация) который приводит к 20%-ному тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен (индекс токсичности равен 20). Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют о том, что образец безвреден для человека.

Вычисление величин ЕС проводят с использованием гамма-функции. Гамма-функция (G) представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой G=(Io-I)/I, где Io и I соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте. Функция G очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец высоко токсичен. График G-функции в логарифмических координатах как функция изменения объема пробы (или концентрации отдельного вещества) есть теоретически прямая линия молекулярности реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими эти токсиканты в тест-объекте. Люминометр "Биотокс-10" позволяет представлять величины G для каждой пробы, а также автоматически вычисляет величины ЕС20 и ЕС50.

Количественным параметром токсичности ПК продукции является степень разбавления образца по отношению к исходному продукту, приводящая к величине параметров ЕС20 (токсичности) и ЕС50 (острой токсичности). Количественным параметром оценки качества ПК продукции по сравнению с эталоном этой продукции, оценки ингредиентов ПК продукции и оценки фототоксичности ПК продукции служит индекс токсичности.

6. Оборудование, химическая посуда и реактивы

Измерительный прибор - люминометр типа "Биотокс-10" с набором кювет на 1,5 мл

Лиофилизированная культура микроорганизмов "Эколюм" или ферментные препараты бактериальной люциферазы, ТУ 2639-236-00209792-01

Весы аналитические с погрешностью взвешивания не более 1 мг, ГОСТ 24104-88

рН-метр, ГОСТ 25 7416 071* или аналоги

________________

* Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.     

Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474

Холодильник бытовой, обеспечивающий температуру от -18 до 4°С

Пробирки с притертыми пробками объемом 3-5 мл, ГОСТ 1770-74

Дозаторы пипеточные на объемы 1,0-0,1 мл

Цилиндры вместимостью 25, 50 мл, второго класса точности, ГОСТ 1770

Воронки делительные на 100 мл, типа ВД-1-100

Фильтры АФА-ВП-10, ТУ 95-743-80* или обеззоленные типа ФОБ, ТУ 6-09-1678

________________

* Документ в информационных продуктах не содержится. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

7. Характеристика тест-объекта "Эколюм" и прибора "Биотокс-10"

Биосенсор "Эколюм" представляет собой лиофилизированные люминесцентные бактерии или бесклеточные препараты, содержащие бактериальную люциферазу. Производится в соответствии с требованиями ТУ 2639-236-00209792-01. Биосенсор находится в стеклянных флаконах в среде инертных газов. При температуре 2-4°С и ниже имеет гарантированный срок хранения не менее 1 года.

Специализированный люминометр "Биотокс-10" является измерительным прибором, предназначенным для проведения токсиколого-гигиенического мониторинга объектов окружающей среды, с использованием микробных биолюминесцентных сенсоров серии "Эколюм". Сочетание биохимического датчика с современной электронной аппаратурой позволяет обнаруживать с высокой достоверностью чрезвычайно малые количества токсических соединений и их смесей. В приборе используется простая и надежная технология отбора и предъявления проб, которая безопасна при проведении экологической экспертизы в лабораторных условиях.