Методические рекомендации по использованию поведенческих реакций животных в токсикологических исследованиях для целей гигиенического нормирования
3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ "ФОНА" ПОВЕДЕНЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ УСЛОВНОРЕФЛЕКТОРНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЖИВОТНЫХ
3.1. Выработка и закрепление условных рефлексов
Наиболее приемлемым видом лабораторных животных, используемых для изучения поведения при действии токсичных веществ, являются крысы белые. Большинство применяемых камер конструкции Л.И.Котляревского, Ю.П.Фролова, Н.С.Правдина и др. рассчитано именно на данный вид животных. Наиболее широко используется двигательно-пищевая методика на крысах в камере Л.И.Котляревского с объективной регистрацией показателей (в различных модификациях). Принцип методики заключается в выработке на основе безусловного пищевого рефлекса условного двигательного рефлекса на звуковой, световой или комбинированный раздражитель. Выработку условных рефлексов в камерах такого типа начинают с угашения ориентировочного рефлекса на новую для животного ситуацию. Для этих целей каждую особь ежедневно помещают в камеры на 10-15 минут. В течение 1-2 дней крысы привыкают к обстановке и с помощью экспериментатора обучаются открывать дверцу кормушки и брать корм. Предварительно, в течение 24 часов животных лишают пищи, за исключением молока, которое дают из расчета 10 мл на одно животное 1 раз в сутки. Для пищевого подкрепления лучше всего использовать хлебные шарики из свежего хлеба, пропитанные витаминизированным рыбьим жиром. Размер и масса хлебных шариков должны быть, по возможности, одинаковыми (около 1 г). В последующем, после угашения ориентировочного рефлекса (на 3-4 день), приступают к выработке и закреплению положительного рефлекса на корм: животное приучают самостоятельно открывать дверцу кормушки и брать пищу. Добившись упрочения рефлекса на кормушку (требуется 1-2 дня), приступают к выработке положительного условного рефлекса на звук (зуммер частотой 400 или 800 Гц). Длительность звука - 5 сек, после чего следует пищевое безусловное подкрепление. В дальнейшем, спустя 3-5 дней, дается условный раздражитель и животное одновременно получает подкормку. В случае, если животное быстро реагирует на пищевое подкрепление (в среднем требуется 5-8 сеансов), проводят отставление условного сигнала от безусловного подкрепления, постепенно увеличивая его до 5 сек. Условный рефлекс на звук считается выработанным и закрепившимся, когда на подачу 10 условных раздражителей животные отвечают 10 положительными реакциями. В среднем, на всю подготовку требуется 3-4 недели. Следующим этапом является выработка положительного условного рефлекса на световой раздражитель (эл. лампочка напряжением 6 вольт), которая проводится аналогично вышеописанному.
Чтобы не произошло угашение на звуковой раздражитель, каждый сеанс в дальнейшем начинают с подачи звука, а в последующем подаются световые сигналы. Образование и закрепление положительных условных рефлексов на звук и свет осуществляют до тех пор, пока длительность латентного периода, величина и общее время рефлекса будут стабильны на оба раздражителя. После этого можно приступить к выработке дифференцировки: условный сигнал (звук), но не подкрепляемый безусловным (пищевым) раздражением. В связи с трудоемкостью (вдвое больше времени), в настоящее время большинство исследователей исключили этот этап из схемы изучения условнорефлекторной деятельности животных.
Угашение рефлексов производят на один из раздражителей (звук или свет) следующим образом: как обычно, положительный раздражитель подкрепляется, а затем пищевое подкрепление отсутствует. Животное вначале по-прежнему реагирует на раздражитель, но при отсутствии подкрепления идет постепенно (за 12-25 сочетаний) угашение рефлекса. Принято считать, что рефлекс угашен, если животное не отвечает на раздражитель 5-10 раз подряд. После исчезновения положительного условного рефлекса тотчас приступают к его восстановлению, т.е. положительный раздражитель подкрепляется.
Рефлекс считается восстановленным (в среднем 2-5 сочетаний), если животное 5 раз подряд отвечает на положительный раздражитель.
Функциональное состояние центральной нервной системы характеризуют такие показатели, как:
1) скорость появления и закрепления положительного условного рефлекса на раздражитель (число сочетаний);
2) длительность скрытого периода рефлекса (сек);
3) величина скрытого периода (условн. ед.);
4) время рефлекса (сек);
5) количество толчков дверцы и кормушки;
6) % выпадения положительных рефлексов;
7) скорость угашения и восстановления условных рефлексов (число сочетаний).
3.2. Установление "фона" поведенческой деятельности животных
Исходные показатели условнорефлекторной деятельности (фон) перед затравкой проверяют на стабильность: проводят 10-12 сеансов 3 дня подряд. В норме высшая нервная деятельность крыс характеризуется следующими параметрами:
1) длительность скрытого периода - 0,602,00 сек.
2) величина рефлекса - 150,0250,0 усл. ед.
3) время рефлекса - 2,003,00 сек.
4) количество толчков дверцы кормушки - 1-2.
Биологическая значимость показателей условнорефлекторной деятельности, определенная с помощью коэффициента вариации (), составляет соответственно: 19%; 21,3%; 14,4%; 15,6%, что дает право отнести эти константы к пластичным.
Для регистрации этих показателей в усовершенствованной камере Л.И.Котляревского используют блок-приставку программного управления, состоящую из электронных счетчиков импульсов*.
___________________
* Рационализаторское предложение N 41 от 17.V.75 г. Цапко В.Г. и соавт.: КНИИГТиПЗ.
Перед динамическими исследованиями простых поведенческих тестов также необходимо "фоновое" обследование и тщательный подбор групп.
Метод "вращающегося конуса" требует предварительной (3 раза) тренировки животных с целью исключения возможных генетических нарушений двигательной координации и вестибулярного аппарата.
Применение "комплексной" установки для одновременного определения вертикального и горизонтального компонентов двигательной активности, "норкового рефлекса" и эмоциональной реактивности требует исключения из опыта "горизонтального" поведенческого типа животных с отсутствием вертикальной двигательной активности, т.е. с преобладанием пассивно-оборонительной реакции на новые условия обстановки.
При проведении исследований необходимо учитывать физиологические колебания поведенческих показателей в зависимости от времени суток и пола животных.