МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ПОВЕДЕНЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ЖИВОТНЫХ В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ГИГИЕНИЧЕСКОГО НОРМИРОВАНИЯ

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель Главного Государственного санитарного врача СССР А.И.Заиченко 14 апреля 1980 г. N 2166-80

В настоящих "Методических рекомендациях" изложены основные принципы и методические приемы по экспериментальной оценке действия промышленных ядов на нервную систему.

Методические рекомендации рассчитаны на специалистов научно-исследовательских учреждений гигиенического профиля (токсикологов и гигиенистов) системы Минздрава СССР и лабораторий токсикологии отраслевых институтов.

Авторы: профессор, докт. мед. наук Е.Н.Буркацкая, ст. н. сотрудник, канд. мед. наук В.Ф.Витер (Киевский НИИ гигиены труда и профзаболеваний); ст. науч. сотрудник, канд. мед. наук Л.А.Тимофиевская, ст. науч. сотрудник Е.С.Балынина, мл. науч. сотрудник, канд. биол. наук К.А.Веселовская (НИИ гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР); ст. науч. сотрудник, канд. мед. наук Л.Ф.Шашкина, мл. науч. сотрудник М.И.Голубева (филиал ВНИХФИ, Купавна, Московской обл.).

В настоящее время в токсикологии существует несколько направлений в изучении поведенческих реакций экспериментальных животных. Из них необходимо выделить 2 направления. Первое - использование метода условных рефлексов, второе - применение поведенческих тестов, основанных на изучении ориентировочно-исследовательской реакции.

Методологической основой, способной синтезировать отдельные реакции поведенческого характера с общефизиологических позиций, является теория о функциональной системе, нарушение целостности которой приводит к изменению поведенческого акта.

Метод условных рефлексов вошел в число весьма распространенных методов исследований, применяемых для оценки токсичности новых химических веществ с целью экспериментального обоснования гигиенических нормативов. Наиболее обоснованно применение указанного метода для определения порога острого действия нейротропных ядов, а также для выяснения механизма действия на центральную нервную систему с параллельным использованием нескольких методик. Высокая пластичность высшей нервной деятельности затрудняет трактовку результатов применения метода условных рефлексов в хроническом эксперименте, т.к. наблюдаются волнообразные изменения, чередование периодов нарушения с периодами полного восстановления, несмотря на продолжающуюся затравку.

Вследствие большой трудоемкости классического метода условных рефлексов для целей токсикологии зачастую используют более простые методы, например условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ), условный рефлекс одного сочетания и поведенческие реакции.

Значительное повышение интереса исследователей к использованию поведенческих реакций объясняется, прежде всего, доступностью и высокой чувствительностью методов их изучения. Последнее объясняется особенностью нейрофизиологического механизма протекания поведенческих реакций, физиологичностью условий исследования и регистрации поведения. Поведение, как биологический параметр, может быть количественно измерено, на этом свойстве основаны методы регистрации поведенческих реакций, которые с успехом применяются при изучении высшей нервной деятельности в физиологии, фармакологии, психогенетике. В токсикологии также выделился самостоятельный раздел - поведенческая токсикология.

Основой проявления любых поведенческих реакций животных является ориентировочный рефлекс (О.Р.). Понятие об О.Р. разработано школой И.П.Павлова.

Одной из основных характеристик О.Р. следует признать то, что он является установочной реакцией, отражающей деятельность целого организма. Поэтому поведенческие реакции следует рассматривать, прежде всего, в качестве интегральных показателей состояния организма, а при выраженном нейротоксическом действии в качестве чувствительных специфических тестов.

О.Р. возникает как безусловный рефлекс, протекает как условный и проявляется при действии нового, необычного раздражителя, независимо от его качества (1-я фаза - реакция на новизну), в виде двигательной реакции, направленной на обеспечение наилучшего восприятия раздражителя (2-я фаза - по Павлову, рефлекс "что такое?"). Основой его являются двигательно-установочные рефлексы, двигательная активность. Ввиду сложного состава О.Р. предлагается термин ориентировочная реакция (по Д.А.Бирюкову), в литературе также встречается термин ориентировочно-исследовательская реакция или исследовательское поведение. Первичный анализ раздражителей с помощью О.Р. очень высок, а двигательная реакция поддается точной регистрации.

Одновременно с двигательным компонентом ориентировочно-исследовательской реакции проявляется и вегетативная деятельность (дефекация, мочеиспускание, почесывание, умывание и др.), которая также поддается количественному учету.

Изменения унитарных поведенческих реакций под влиянием различных химических соединений позволяют предполагать и нарушения в половом поведении животных.

Половое поведение может быть определено как совокупность поведенческих актов, обеспечивающих возможность спаривания особей. При более широком рассмотрении вопроса к половому поведению следует отнести такие зависимые от пола реакции, направленные на воспроизводство потомства, как материнский и гнездостроительный инстинкты.

Изучение полового поведения следует проводить для оценки отдаленных последствий при воздействии соединений, обладающих выраженной специфической активностью и влияющих на состояние центральной нервной и эндокринной систем.

Так, показано, что андрогены при воздействии на беременных самок оказывают маскулинизирующее действие на женское потомство, проявляющееся как в анатомических дефектах урогенитальной области самок, так и в нарушении полового поведения самок и их партнеров - интактных самцов (Goung и соавт., 1964; М.И.Голубева и соавт., 1977).

Большая численность поведенческих методик, основанных на исследовании поведения вообще и О.Р. в частности, обусловила необходимость систематизировать, провести сравнительную оценку их информативной значимости, выявить и предложить для широкого применения в токсикологических исследованиях ряд наиболее современных высокочувствительных, адекватных и простых в исполнении поведенческих тестов, характеризующих в своей сущности регулирующую, интегрирующую, координирующую и коррелирующую функции центральной нервной системы.

При выборе методов исследования поведенческих реакций предпочтение следует отдавать чувствительным, доступным и нетрудоемким методам, физиологичным в своей основе. Наиболее доступными для измерения параметрами являются двигательная активность и двигательная координация животных. Из набора простых поведенческих методик для токсикологических исследований в настоящее время рекомендуются:

1) определение двигательного "вертикального компонента";

2) горизонтальная и вертикальная двигательная активность;

3) "норковый рефлекс";

4) изучение двигательной координации при вращении;

5) комплексная оценка поведения (вертикальная и горизонтальная активность, число заглядываний в норки, эмоциональная реактивность).

Большим преимуществом указанных методов является доступность оборудования.

I. ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ

     
I.* ЭТАПЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

___________________

* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

Экспериментальное изучение поведенческих реакций в токсикологии состоит из трех этапов:

I. подготовительного;

II. исследовательского;

III. статистической обработки экспериментальных данных.

Подготовительный этап включает:

1) выбор животных и подготовку условий их содержания,

2) установление типа высшей нервной деятельности животных,

3) определение "фона" поведенческих реакций:

3.1 выработку и закрепление условных рефлексов;

3.2 установление нормального фона поведенческой деятельности животных.

II. Исследовательский этап включает использование конкретных методов и динамическое наблюдение за показателями поведения.

III этап включает правильный подбор и применение методов статистической обработки экспериментальных данных.

1. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЙ ЭТАП

1. Выбор животных и условия их содержания.

В зависимости от условий опыта (острые, подострые или хронические), животные отбираются по возрасту и массе тела. Например, белые крысы и мыши должны иметь следующие параметры:

Таблица 1

Особое внимание обращают на внешний вид животных (блеск шерстных покровов, опрятность, отсутствие внешних признаков болезни, дефекты онтогенетического развития и т.п.).

Работать необходимо с половозрелыми особями генетически чистых линий - Вистар и др., а при отсутствии таковых - с беспородными животными. В качестве генетического стандарта мышей рекомендуется линия SHK.

На всех этапах изучения поведения животных должны строго соблюдаться одинаковые условия их содержания, ухода, исследований:

1) постоянная экспериментальная обстановка (отдельное помещение со стандартным освещением, изолированное от посторонних раздражителей),

2) не более 1-2 экспериментаторов-исследователей,

3) полноценный пищевой рацион, богатый витаминами,

4) одинаковое время кормления и исследования с учетом биоритмов поведенческих реакций,

5) содержание животных в клетках в количестве не более 10 особей одного пола,

6) четкая маркировка каждого животного,

7) обработка переносного оборудования или закрепление его за каждой экспериментальной группой.

Исследования с помощью метода "открытое поле" проводятся в затемненном помещении. При измерении двигательной активности требуется проводить тщательную обработку площади манежа во избежание воздействия запаховых раздражителей, особенно при работе с разным полом животных. Для каждого эксперимента при определении поведенческих реакций желательно выделить отдельную группу (количество животных подбирается в зависимости от вариабельности показателя, но не менее 12 в группе) на каждый метод, так как в процессе исследования может утрачиваться "новизна раздражителя".

Наблюдение полового поведения нужно проводить в специальной комнате, в которой присутствуют только экспериментаторы (1-2 человека) и животные. Для наблюдения удобно использовать специальные клетки с передней стеклянной стенкой.

Для проведения эксперимента следует отбирать половозрелых здоровых животных. При этом необходимо учитывать влияние индивидуального опыта животных. Известно, что самцы крыс, имеющие опыт спаривания, предпочитают запах самок в эструсе запаху самок, не готовых к спариванию (Beach, 1947). У самцов, не имеющих соответствующего опыта, а также у кастрированных самцов, такого предпочтения не отмечалось. Следует иметь в виду, что готовность к спариванию и стремление контактировать с самцами у самок проявляется только в период проэструса и эструса (Eliasson, Меуеrson, 1975). Кроме того, в эксперименте не рекомендуется отбирать животных, выращенных в изоляции, так как, по данным некоторых исследователей, (Gerall и соавт., 1967) это резко снижает их способность к спариванию по сравнению с теми животными, которые имели возможность контактировать с особями своего вида.

Наилучшее время наблюдения полового поведения - 23-24 - 1 час, поскольку у животных, ведущих ночной образ жизни (к которым относятся грызуны), в этот период наступает пик активности. В целях приближения ко времени пика активности наблюдение можно проводить через 5-6 часов после наступления темновой фазы. Для осенне-зимнего сезона это 21-23 часа.

2. УСТАНОВЛЕНИЕ ТИПА ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ

В процессе отбора животных определяется тип высшей нервной деятельности каждой особи в отдельности, так как возникновение и развитие патологии химической этиологии связано с состоянием возбудительного и тормозного процессов. Установлено, что уже в первых опытах поведение крыс имеет разнонаправленный характер: у активных отмечается явно выраженная ориентировочно-исследовательская реакция на неизвестную обстановку, в результате чего они быстро находят пищевое подкрепление (в случае выработки условных рефлексов). Животные с преобладанием пассивно-оборонительной реакции на новые ситуационные условия (отмечается выраженный вегетативный компонент) должны быть из опыта исключены.

Для определения типологических особенностей большое значение имеет также время появления рефлекса, скорость закрепления его и устойчивость, величина и длительность рефлекса, скорость угашения и восстановления.

Комплекс перечисленных качественных характеристик должен дать экспериментатору представление о типе высшей нервной деятельности животных.

Если группа подопытных животных состоит из особей разных типов высшей нервной деятельности, необходимо, чтобы и животные контрольной группы состояли из такого же количества и обладали такими же показателями нервной деятельности.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ "ФОНА" ПОВЕДЕНЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ УСЛОВНОРЕФЛЕКТОРНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЖИВОТНЫХ

3.1. Выработка и закрепление условных рефлексов

Наиболее приемлемым видом лабораторных животных, используемых для изучения поведения при действии токсичных веществ, являются крысы белые. Большинство применяемых камер конструкции Л.И.Котляревского, Ю.П.Фролова, Н.С.Правдина и др. рассчитано именно на данный вид животных. Наиболее широко используется двигательно-пищевая методика на крысах в камере Л.И.Котляревского с объективной регистрацией показателей (в различных модификациях). Принцип методики заключается в выработке на основе безусловного пищевого рефлекса условного двигательного рефлекса на звуковой, световой или комбинированный раздражитель. Выработку условных рефлексов в камерах такого типа начинают с угашения ориентировочного рефлекса на новую для животного ситуацию. Для этих целей каждую особь ежедневно помещают в камеры на 10-15 минут. В течение 1-2 дней крысы привыкают к обстановке и с помощью экспериментатора обучаются открывать дверцу кормушки и брать корм. Предварительно, в течение 24 часов животных лишают пищи, за исключением молока, которое дают из расчета 10 мл на одно животное 1 раз в сутки. Для пищевого подкрепления лучше всего использовать хлебные шарики из свежего хлеба, пропитанные витаминизированным рыбьим жиром. Размер и масса хлебных шариков должны быть, по возможности, одинаковыми (около 1 г). В последующем, после угашения ориентировочного рефлекса (на 3-4 день), приступают к выработке и закреплению положительного рефлекса на корм: животное приучают самостоятельно открывать дверцу кормушки и брать пищу. Добившись упрочения рефлекса на кормушку (требуется 1-2 дня), приступают к выработке положительного условного рефлекса на звук (зуммер частотой 400 или 800 Гц). Длительность звука - 5 сек, после чего следует пищевое безусловное подкрепление. В дальнейшем, спустя 3-5 дней, дается условный раздражитель и животное одновременно получает подкормку. В случае, если животное быстро реагирует на пищевое подкрепление (в среднем требуется 5-8 сеансов), проводят отставление условного сигнала от безусловного подкрепления, постепенно увеличивая его до 5 сек. Условный рефлекс на звук считается выработанным и закрепившимся, когда на подачу 10 условных раздражителей животные отвечают 10 положительными реакциями. В среднем, на всю подготовку требуется 3-4 недели. Следующим этапом является выработка положительного условного рефлекса на световой раздражитель (эл. лампочка напряжением 6 вольт), которая проводится аналогично вышеописанному.

Чтобы не произошло угашение на звуковой раздражитель, каждый сеанс в дальнейшем начинают с подачи звука, а в последующем подаются световые сигналы. Образование и закрепление положительных условных рефлексов на звук и свет осуществляют до тех пор, пока длительность латентного периода, величина и общее время рефлекса будут стабильны на оба раздражителя. После этого можно приступить к выработке дифференцировки: условный сигнал (звук), но не подкрепляемый безусловным (пищевым) раздражением. В связи с трудоемкостью (вдвое больше времени), в настоящее время большинство исследователей исключили этот этап из схемы изучения условнорефлекторной деятельности животных.