МУК 4.2.3695-21 Методы микробиологического контроля почвы

IV. Определение ОКБ

4.1. Определение общих (обобщенных) колиформных бактерий, в том числе Escherichia coli, бактерий группы кишечных палочек (БГКП), лактозоположительных кишечных палочек (колиформы) (далее - ОКБ) титрационным методом

Из первого разведения почвенной суспензии (1:10), прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой (дозатором) берут 10,0 см и засевают в 90,0 см лактозо-пептонной среды (далее - ЛПС) или среды Кесслера или в среду Эйкмана с лактозой, что соответствует посеву 1 г почвы.

По 1,0 см нативной почвенной суспензии и последующих ее разведений (0,1 г, 0,01 г, 0,001 г, то есть 10, 10, 10 разведения и т.д.), подготовленных по п.3.2, вносят в пробирки с 9,0 см питательной среды (ЛПС, среда Кесслера или среда Эйкмана с лактозой).

Посевы инкубируют до 48 ч при (37±1)°С с предварительным просмотром посевов через 16-18 ч инкубации.

При наличии в посевах признаков роста (помутнение, образование кислоты и газа или только помутнение) производят высев петлей на поверхность плотных питательных сред (например, Эндо, среды ТТХ агар с тергитолом 7, агар МакКонки) с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Чашки с посевами инкубируют при температуре (37±1)°С в течение 16-18 ч. Посев из накопительных питательных сред можно производить на хромогенные питательные среды.

При обнаружении грамотрицательных и оксидазоотрицательных колоний идентификация проводится путем подтверждения ферментации лактозы. По 2-3 колонии каждого типа засевают параллельно в две пробирки с питательной средой, разлитой в количестве 4,0-5,0 см (например, полужидкая лактоза, среда Гисса с лактозой или аналогичные среды): одну пробирку инкубируют при температуре (37±1)°С, вторую - при температуре (44±1)°С. Учет производят через 16-18 ч инкубации.

Образование кислоты и газа при температуре (37±1)°С свидетельствует о наличии ОКБ. Наличие E. coli подтверждают образованием кислоты и газа при температуре (44±1)°С.

Для подтверждения наличия в пробе E. coli можно использовать лактозный бульон с борной кислотой (подтверждение роста и образование газа) или среду, содержащую триптофан (выявление способности бактерий продуцировать индол). Продукция индола определяется реактивом Ковача или индикаторной полоской.

Учет результатов проводят по приложению 2 к настоящим МУК.

Результаты микробиологического исследования почвы представляют в виде индекса (КОЕ/г или кл/г) - количество бактерий (КОЕ или клеток) в 1,0 грамме почвы.

Результат по показателю ОКБ, в т.ч. E. coli отрицательный (не обнаружено), если:

- в среде накопления нет признаков роста через 48 ч инкубации;

- на плотной питательной среде нет роста или отмечается рост нехарактерных для колиформных бактерий колоний;

- все колонии оксидазоположительные;

- отсутствует образование кислоты и газа при идентификации.

В случае наличия кислоты и газа при (37±1)°С и отсутствии положительной реакции при (44±1)°С, результат исследования представляют числовым выражением количества ОКБ (КОЕ или клеток) в 1 г почвы (КОЕ/г, кл/г). При наличии кислоты и газа при (37±1)°С и положительной реакции при (44±1)°С, результат исследования выражают суммарным числовым выражением количества ОКБ, в том числе E. coli (КОЕ или клеток) в 1 г почвы (КОЕ/г, кл/г).

4.2. Определение ОКБ методом мембранной фильтрации

Для микробиологических целей используются фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм и другие фильтрующие мембраны с аналогичной способностью фильтрации. Метод основан на фильтрации почвенной суспензии через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде (например, Эндо, среда ТТХ агар с тергитолом 7, агар МакКонки) и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Мембранные фильтры готовятся к анализу в соответствии с инструкцией изготовителя.

Для подготовки фильтровального аппарата воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым (ватным) тампоном, смоченным спиртом ректификованным, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут стерильным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой. В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем, затем создают вакуум. При посеве нескольких разведений одной пробы следует фильтровать через один фильтровальный аппарат без обеззараживания сначала объемы меньших разведений, а затем больших, меняя каждый раз фильтры. Перед фильтрованием каждой новой пробы прибор обеззараживают.

Фильтрации подлежат нативная почвенная суспензия и ее разведения, подготовленные по п.3.2, в объеме не менее 10 см (1 см почвенной суспензии вносят в 10 см стерильной водопроводной воды).

После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край стерильным пинцетом и переносят фильтр, не переворачивая, на поверхность плотных питательных сред (например, Эндо, среды ТТХ агар с тергитолом 7, агар МакКонки, хромогенные), избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром и исключая соприкосновение фильтров между собой. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх. Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной пробы, номера и даты посева.

Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре (37±1)°С в течение 16-18 ч.

Подсчет колоний проводят на фильтре. Для повышения точности анализа учет ведут на фильтрах с числом типичных для колиформных бактерий колоний: не более 30 для фильтров с диаметром диска 35 мм и не более 50 для фильтров с диаметром диска 47 мм.

При наличии на фильтре грамотрицательных и оксидазоотрицательных культур идентификация проводится в соответствии с п.4.1.

Результаты микробиологического исследования почвы представляют в виде индекса (КОЕ/г или кл/г) - количество бактерий (КОЕ или клеток) в 1,0 г почвы.

При использовании метода мембранной фильтрации индекс (КОЕ/г, кл/г) рассчитывают путем умножения суммы колоний ОКБ, выросших на фильтре, на 10(n - степень соответствующего десятикратного разведения).

Результат по показателю ОКБ, в т.ч. E. coli отрицательный (не обнаружено), если: