ГОСТ 32636-2020 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Субхроническая ингаляционная токсичность: 90-дневное исследование

     4 Исследование токсичности

4.1 Предельные концентрации

В отличие от исследований острой токсичности в исследованиях субхронической ингаляционной токсичности уровень предельных концентраций не установлен. При выборе максимальной концентрации исследуемого вещества следует учитывать:

1) максимально достижимую концентрацию,

2) необходимость поддержания достаточного количества кислорода и/или

3) рекомендации о гуманном обращении с животными.

При отсутствии пределов, основанных на результатах исследований, могут быть использованы концентрации для хронической токсичности в соответствии с Согласованной на глобальном уровне системой классификации и маркировки химических веществ ООН (т.е. вплоть до максимальной концентрации 5 мг/дм - для аэрозолей, 20 мг/дм - для паров и 20,000 ppm - для газов). Если при испытании газов или легколетучих химических веществ (например, хладагентов) возникла необходимость превысить предельные концентрации, то следует привести обоснование. Испытание частиц аэрозолей концентрацией более 2 мг/дм можно проводить только в том случае, если можно обеспечить/поддерживать размер частиц, пригодный для вдыхания [1].

4.2 Исследование по определению диапазона доз

4.2.1 План основного исследования в значительной степени зависит от информации, полученной в ходе исследования по определению диапазона доз. При отсутствии достаточной информации для обеспечения надежности проведения основного исследования должно быть выполнено исследование по определению диапазона доз. Несмотря на то, что основной целью исследования по определению диапазона доз является представление информации для выбора уровней концентрации для основного исследования, оно также может представить дополнительную информацию, обеспечивающую надежность основного исследования. Это в первую очередь относится к исследованию плохо растворимых твердых аэрозолей. Исследование по определению диапазона доз может дать информацию относительно аналитических методов, распределения частиц по размерам, системной токсичности, токсикокинетики, растворимости химических веществ в легких, транслокации частиц, механизмов токсического действия, клинической патологии (гематологии/клинической химии), гистопатологии, биомаркеров повреждения легких, чувствительности в зависимости от пола, данных BALF и оценки максимальной концентрации, не вызывающей неблагоприятного воздействия (NOAEC), минимальной концентрации, не вызывающей неблагоприятного воздействия (LOAEC), максимально допустимой концентрации (МТС) и/или стандартной концентрации (ВМС) в основном исследовании. Руководитель исследования должен использовать исследование по определению диапазона доз для определения наивысшей допустимой концентрации, не вызывающей чрезмерного стресса для животных, и параметров, которые лучше всего будут характеризовать токсичность исследуемого химического вещества. BAL может выполняться после прекращения исследований по определению диапазона концентраций и через определенные промежутки времени после прекращения воздействия. При исследовании твердого аэрозоля выполняют оценку растворимости химического вещества и нагрузки на легкие после воздействия для принятия решения о продолжительности основного исследования после воздействия и временных точках наблюдения после прекращения воздействия (РЕО). Кроме того, измерения нагрузки на лимфатические узлы, связанные с легкими (LALN), могут предоставить информацию о транслокации.

4.2.2 Исследование по определению диапазона доз может включать группы для одного или более уровней концентрации исследуемого химического вещества и контрольную группу. Воздействию каждого уровня концентрации подвергают не более пяти самцов и пяти самок. Определение диапазона концентраций должно продолжаться не менее 5 дней, но, как правило, не более 28 дней и может включать период после воздействия, поэтому количество животных должно быть соответствующим образом скорректировано. При исследовании плохо растворимых частиц может потребоваться, чтобы исследование по определению диапазона концентраций длилось более 28 дней для обеспечения надежной оценки растворимости химического вещества и нагрузки на легкие. Обоснование выбора концентрации для основного исследования необходимо отразить в отчете по основному исследованию. Подробные указания по определению диапазона концентраций приведены в [1].

4.3 Основное исследование

4.3.1 Основное исследование включает не менее трех уровней концентрации исследуемого химического вещества и одновременный отрицательный контроль (воздуха) или носителя (растворителя) (см. 5.1). В настоящем стандарте рассматриваются два плана исследования в зависимости от природы исследуемого химического вещества (см. приложение А). В дополнение к варианту А, обычно используемому для исследования химических веществ (таких, как газ, пар, аэрозоль или их смесь), для исследования химических веществ, которые могут оставаться в легких, предусмотрено использование варианта В. Несмотря на то, что схемы вариантов А и В, приведенные в приложении А, демонстрируют типичные планы исследования, фактический план исследования остается на усмотрение руководителя исследования. При планировании исследования и выбора надлежащего уровня воздействия (см. 4.2.1) следует использовать информацию, полученную в ходе исследования по определению диапазона концентраций, и все имеющиеся соответствующие данные.

4.3.2 Каждая подопытная группа состоит не менее чем из 10 самцов и 10 самок грызунов, которых подвергают воздействию исследуемого химического вещества в течение 6 ч в день 5 дней в неделю в течение 13 недель (общая продолжительность исследования - не менее 90 дней). Животные также могут подвергаться воздействию 7 дней в неделю. При исследовании химического вещества, которое предположительно удерживается в легких (см. вариант В, приложение А), одновременно подвергают воздействию и животных вспомогательных групп, состоящих из пяти самцов на концентрацию (т.е. не менее 20 животных), в тех же условиях, что и группы основного исследования, и для представления информации об удерживаемой дозе оценивают РЕО-1 измерением нагрузки на легкие после прекращения воздействия. Если исследование по определению диапазона концентраций показывает, что животные одного пола более восприимчивы к воздействию исследуемого вещества, то воздействию разных уровней концентраций подвергают животных разных полов, чтобы оптимизировать ответ на концентрацию, как указано в 4.3.5.

4.3.3 Если воздействию только через нос подвергают грызунов других видов, кроме крыс, то можно скорректировать максимальную продолжительность воздействия для сведения к минимуму дистресса, характерного для данного вида. При использовании продолжительности воздействия менее 6 ч в день или необходимости проведения длительного (например, 22 ч в день) исследования воздействия на все тело должно быть представлено обоснование.

4.3.4 Во время экспозиции следует воздержаться от кормления, если время воздействия не превышает 6 ч. Во время воздействия на все тело животным можно давать воду.

4.3.5 Выбранные целевые концентрации должны обеспечивать идентификацию органов-мишеней и показывать четкую зависимость "концентрация - ответ":

- высокий уровень концентрации должен вызывать токсический эффект, но не приводить к летальному исходу или устойчивым признакам интоксикации, которые могут привести к летальному исходу, либо могут препятствовать обоснованной оценке результатов. При испытании аэрозолей максимальная концентрация может быть максимально достижимым уровнем, который обусловлен соблюдением стандартного распределения частиц по размерам (см. 6.5.1);

- промежуточный уровень (уровни) концентрации должен быть выбран таким образом, чтобы обеспечить классификацию токсического эффекта при воздействии низких и высоких концентраций;

- низкий уровень концентрации, который в идеале будет равен NOAEC, будет вызывать слабые эффекты или вообще не вызывать признаков интоксикации.

4.4 Промежуточные умерщвления

Если запланированы промежуточные умерщвления во время основного исследования воздействия вещества, число животных на каждом уровне воздействия должно быть увеличено на число животных, которые будут умерщвлены до завершения исследования. При использовании промежуточных умерщвлений необходимо представить обоснование и учитывать их должным образом в статистическом анализе.

4.5 Вспомогательные группы

4.5.1 К основному исследованию могут быть добавлены дополнительные вспомогательные группы для оценки выведения, персистенции, отдаленного проявления интоксикации или нагрузки на легкие в течение соответствующего периода после воздействия.

Примеры основных исследований со вспомогательными группами приведены в приложении А. Руководитель исследования может изменить план исследования на основе физико-химических характеристик и кинетики исследуемого химического вещества для получения наиболее достоверных данных. Животных всех вспомогательных групп одновременно с подопытными животными в основном исследовании подвергают воздействию одинаковых уровней концентрации и при необходимости проводят одновременный контроль воздуха или носителя (растворителя) (см. 4.6). Планирование и метод исследований во вспомогательных группах зависят от того, является ли исследуемое химическое вещество твердым аэрозолем и может ли оно привести к задержке в легких (см. блок-схему принятия решений в отношении нагрузки на легкие, приведенную в приложении А). Если исследуемое химическое вещество может удерживаться в легких, основное исследование проводят по варианту В. В остальных случаях основное исследование проводят по варианту А. Вспомогательные группы могут быть включены для оценки выведения в варианте А. Вариант В предусматривает использование вспомогательных групп для оценки выведения и/или измерения нагрузки на легкие.

4.5.2 Вспомогательные группы восстановления (для исследования выведения) в РЕО-2 по вариантам А и В состоят из пяти самцов и пяти самок на концентрацию. Животные этих групп одновременно с подопытными животными в основном исследовании подвергаются воздействию тех же уровней концентраций. При необходимости параллельно проводят контроль воздуха и/или носителя (растворителя) (см. 4.6).

4.5.3 При исследовании плохо растворимых твердых аэрозолей, которые могут задерживаться в легких (см. вариант В, приложение А), можно добавить одну или две дополнительные вспомогательные группы из пяти самцов на концентрацию для измерения нагрузки на легкие в разные моменты времени после воздействия. Дополнительные измерения нагрузки на легкие (т.е. РЕО-2 и/или РЕО-3) могут быть добавлены к проекту, если руководитель исследования хочет понять кинетику очищения после воздействия исследуемого вещества. Для получения информации о кинетике клиренса обычно требуются результаты трех измерений нагрузки на легкие в разные моменты времени: первое измерение выполняют в течение 24 ч после прекращения воздействия (РЕО-1) и два измерения проводят после определенных периодов времени - РЕО-2 и РЕО-3. Однако в некоторых случаях для получения информации может быть достаточным использование двух временных точек, например когда основная цель состоит в установлении того, что очищение является очень медленным. Измерения нагрузки на легкие предпочтительно проводят на самцах, которые имеют больший минутный объем, чем самки, и, следовательно, могут иметь нагрузку на легкие.

4.5.4 На основании результатов исследования по определению диапазона доз и другой доступной соответствующей информации руководитель исследования должен определить продолжительность периода после воздействия, а также сроки проведения РЕО-2 для групп восстановления и (в случае варианта В) РЕО-3 - для вспомогательных групп с нагрузкой на легкое (см. приложение А). График РЕО-2 и РЕО-3 в варианте В будут зависеть от ожидаемой скорости очищения легких и продолжительности периода восстановления после воздействия. Ниже приведены другие возможные варианты:

- при необходимости руководитель исследования может выбрать схему РЕО-3 перед исследованием группы восстановления (РЕО-2) (если предусмотрено);

- в случае согласованности сроков оценки восстановления и очищения легких может считаться достаточным использование двух временных точек после воздействия исследуемого вещества и измерения нагрузки на легкие, которые могут проводиться только в РЕО-1 (основное исследование) и в РЕО-2 (группа восстановления). Вспомогательная группа в РЕО-3 может быть исключена из исследования;