Вакцина гриппозная инактивированная

Испытания

Описание. Бесцветная или опалесцирующая желтоватая жидкость. Определение проводят визуально.

Подлинность. Каждый подтип и тип антигена должен нейтрализоваться гомологичной сывороткой. Титр с гетерологичной сывороткой должен быть ниже титра с гомологичной сывороткой не менее, чем в 4 раза. Определение проводят на стадиях получения полуфабрикатов: объединенного вирусного концентрата или моновакцины в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Метод постановки РТГА с вирусом гриппа (макрометод). РТГА применяют для установления типа и подтипа вируса, т.е. специфичности, а также для определения нарастания титров специфических антител. Постановка РТГА включает следующие этапы: приготовление взвеси эритроцитов, определение гемагглютинирующего титра антигена в реакции гемагглютинации (РГА) и рабочей дозы вируса, постановка самой реакции. Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты:

- исследуемый антиген (субъединичная моновакцина, вируссодержащая жидкость - аллантоисная или культуральная);

- иммунные/диагностические сыворотки к различным типам (А и В) и подтипам типа А вируса гриппа;

- фосфатный буферный раствор рН 7,20,2 (ФБР);

- суспензия куриных эритроцитов, 1%.

1. Приготовление взвеси куриных эритроцитов. Для постановки РТГА используют эритроциты петухов. Кровь у петухов берут из сердца или подкрыльцевой вены.

Свежеполученную кровь от 3-5 петухов помещают во флакон со стеклянными бусами или с одним из антикоагулянтов (раствор Альсевера, 5%-й раствор натрия цитрата). Дефибринирование крови проводят немедленно путем интенсивного встряхивания флакона со стеклянными бусами в течение 5-7 мин при температуре (205)°С до выпадения волокон фибрина.

Дефибринированную кровь фильтруют через 4 слоя марли, затем трехкратно отмывают ФБР путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 5 мин или 800200 об/мин в течение (155) мин. Надосадочную жидкость удаляют. Из осадка, принимаемого за 100%, готовят 1% суспензию куриных эритроцитов по объему.

2. Определение гемагглютинирующего титра антигена. В лунках агглютинационного планшета готовят двукратные разведения антигена в объеме 0,4 мл на фосфатном буферном растворе, начиная с 1:10 до 1:1280. В каждую лунку вносят по 0,4 мл 1% суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием планшета и оставляют при температуре (205)°С на 40-45 мин (до оседания эритроцитов в отрицательном контроле).

Реакцию оценивают по "четырехкрестовой" системе. За титр антигена, или одну агглютинирующую единицу (АЕ), принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов (+++ или ++++).

Определение титра антигена сопровождается отрицательным контролем на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. С этой целью в контрольную лунку того же агглютинационного планшета вносят 0,4 мл фосфатного буферного раствора и 0,4 мл 1% суспензии эритроцитов. При отсутствии спонтанной агглютинации на дне лунки выпадает гомогенный с ровными краями осадок эритроцитов (отрицательная реакция).

3. Приготовление рабочей дозы антигена. В РТГА рабочей дозой антигена является то разведение антигена, в 0,2 мл которого содержится 4 агглютинирующие единицы (4 АЕ). Для вычисления ее следует установленную величину титра антигена разделить на 8. Полученная цифра указывает во сколько раз нужно развести антиген, чтобы в 0,2 мл его содержалось 4 АЕ (рабочая доза).

Перед постановкой основного опыта проверяют точность приготовления рабочей дозы (4 АЕ). Для этого в пять лунок горизонтального ряда агглютинационного планшета, начиная со второй, вносят по 0,2 мл фосфатного буферного раствора. В 1-ю и 2-ю лунки добавляют по 0,2 мл приготовленной рабочей дозы антигена. После перемешивания переносят 0,2 мл смеси из лунки в лунку, начиная со 2-й по 5-ю лунку, из 5-й лунки 0,2 мл удаляют. Затем в каждую лунку добавляют по 0,2 мл фосфатного буферного раствора и по 0,4 мл 1% суспензии куриных эритроцитов. В 6-й лунке ставят контроль на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. После встряхивания смесь оставляют при температуре (205)°С на 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле).

При правильном выборе рабочей дозы полная (++++) агглютинация эритроцитов должна наблюдаться только в первых трех лунках. В 4-й и 5-й лунках агглютинация должна отсутствовать. В случае отклонения от указанного выше, разведение антигена должно быть изменено путем добавления соответствующего количества антигена или фосфатного буферного раствора для получения необходимой рабочей дозы. При этом необходимо повторно проверить правильность приготовления рабочей дозы.

4. Постановка реакции торможения гемагглютинации. Готовят двукратные разведения сывороток в лунках агглютинационного планшета, начиная с 1:10 до 1:640 и выше в объеме 0,2 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют по 0,2 мл рабочей дозы антигена (4 АЕ). Смесь встряхивают и после контакта антигена и сыворотки (от 30 мин до 1 ч) при температуре (205)°С в каждую лунку добавляют по 0,4 мл 1% суспензии куриных эритроцитов. Смесь повторно встряхивают, оставляют при температуре (205)°С в течение 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле), после чего производят учет результатов реакции.

При наличии в сыворотке специфических антител наступает задержка агглютинации эритроцитов. За титр сыворотки принимают предельное разведение, вызывающее полную задержку гемагглютинации.

Задержка гемагглютинации указывает на соответствие типа антигена и взятой сыворотки; отсутствие задержки гемагглютинации свидетельствует о несоответствии типа взятой сыворотки антигену.

Примечания

* При исследовании сывороток привитых в РТГА (изучение иммуногенности вакцины) следует учитывать, что сыворотки людей содержат различные полисахариды, которые могут связывать гемагглютинин вируса гриппа и затруднять связывание специфических гриппозных гемагглютинирующих антител. Для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации образцы сыворотки обрабатывают при помощи нейраминидазы холерных вибрионов или ферментом RDE (receptor destroying enzyme).

При наличии готового реактива необходимо следовать требованиям, изложенным в инструкции по применению.

К 1 объему исследуемой сыворотки добавляют 3 объема фермента RDE (разведение сыворотки 1:4). Смесь инкубируют при температуре (371)°С в течение 18-20 часов, а затем прогревают на водяной бане при температуре (51)°С в течение 30 мин. Смесь охлаждают при комнатной температуре, после чего в нее вносят фосфатный буферный раствор (рН 7,2) в объеме, необходимом для получения разведения сыворотки 1:10 (1 объем сыворотки в разведении 1:4 + 1,5 объема фосфатного буферного раствора).

При необходимости длительного хранения обработанную сыворотку (разведение 1:10) хранят при температуре не выше минус 20°С.

Приготовление 0,1 М раствора фосфатного буферного (рН 7,20,2).

Раствор 1. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 17,8 г натрия фосфата двузамещенного 2-водного (), растворяют в 500 мл воды очищенной, доводят объём раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.