22. Суть методов генетической диагностики стрессчувствительности и врожденного иммунного ответа у свиней заключается в выделении фрагмента генов RYR1 и TLR 2 из целого генома животного с помощью специфических праймеров, ограничивающих данный фрагмент.
23. Методы диагностики RYR1 и TLR 2 свиней включают в себя следующие этапы:
взятие проб биологического материала;
выделение ДНК;
проведение амплификации (метод ПЦР) фрагмента гена RYR1, TLR 2 и оценка качества амплификата;
анализ полученных результатов.
24. RYR1 ген может содержать в своей структуре точечную мутацию в позиции 1843, являющуюся причиной чрезмерно острой реакции свиней на стресс - злокачественного гипертермического синдрома и низкого качества мяса (бледное, водянистое, мягкое). Наличие мутации в выделенном фрагменте выявляется с помощью специфического фермента, маркирующего измененный мутацией фрагмент RYR1-гена.
RYR F: 5’ - GTGCTGGATGTCCTGTGTTCCCT-3’, T = 60°C
RYR R: 5’ - CTGGTGACATAGTTGATGAGGTTTG-3’, T = 60°C
25. Toll-подобные рецепторы (TLR) являются важными компонентами врожденного иммунного ответа и имеют решающее значение для иммунной системы. У свиней было идентифицировано десять различных семейств Toll-подобных рецепторов, как мембранных, так и внутриклеточных. Они способны распознавать бактериальные продукты вне клеток и вирусную нуклеиновую кислоту внутри клетки. Таким образом, некоторые TLR локализуются во внутриклеточных компартментах для распознавания вирусной или бактериальной нуклеиновой кислоты. Другие TLR находятся на поверхности клетки и распознают бактериальные продукты (липопротеины, пептидогликаны, липополисахариды). TLR 2 распознают продукты, содержащие бактерии и грибы (ЛПС (лептоспиры)), липоарабиноманнан (микобактерии), липопептиды, зимозан (грибы), (микоплазмы) (грамм+).
TLR 2 F: 5’ - GCTGGACTTCTCCCACTTCC-3’, T = 60°C
TLR 2 R: 5’ - AAGACCAGCATCGGACCAAG-3’, T = 60°C
26. Для проведения ПЦР в объеме 25 мкл используется 50-100 нг геномной ДНК. Пробирки объемом 0,5 мл с 25 мкл реакционной смеси помещаются в термоциклер для проведения 30 циклов амплификации.
Режим амплификации: проводится амплификация: денатурация - 94°C (1 мин); отжиг - 60°C (1 мин); элонгация - 72°C (1 мин); достройка матрично-праймерных комплексов проходит при 72°C (5 мин).