78. Иммунная система у млекопитающих состоит из врожденных и адаптивных иммунных ответов. Адаптивный иммунитет связан с антиген-специфическими ответами T- и B-клеток и наблюдается только у позвоночных. Toll-подобные рецепторы (TLR) играют важную роль в распознавании компонентов патогенов с последующей активацией врожденного иммунного ответа, который затем приводит к развитию адаптивных иммунных ответов.
79. У крупного рогатого скота все 10 генов TLR картированы. Определение генетического разнообразия в этих локусах в отношении устойчивости к определенным заболеваниям у домашнего скота могут быть полезны для генетического отбора по устойчивости к болезням.
80. Суть методов генетической диагностики врожденного иммунного ответа у крупного рогатого скота заключается в выделении фрагмента генов TLR из целого генома животного с помощью специфических праймеров, ограничивающих данный фрагмент.
81. Методы диагностики TLR скота включают в себя следующие этапы:
взятие проб биологического материала;
выделение ДНК;
проведение амплификации (метод ПЦР) фрагмента гена TLR и оценка качества амплификата;
анализ полученных результатов.
82. Для проведения ПЦР в объеме 25 мкл используется 50-100 нг геномной ДНК. Пробирки объемом 0,5 мл с 25 мкл реакционной смеси помещаются в термоциклер для проведения 30 циклов амплификации.
83. Режим амплификации TLR. Денатурация 94°C (5 мин), 14 циклов: денатурация при 94°C (30 сек), отжиг начиная с температуры + 7°C и снижаясь на 0,5°C за цикл (45 секунд) и элонгация 72°C (40 секунд), потом еще 20 циклов денатурация при 94°C (30 сек), отжиг при температуре (согласно таблице 1) (45 секунд) и элонгация при 72°C (40 секунд); заключительный этап достройки матрично-праймерных комплексов проходит при 72°C в течение 5 минут.
84. Концентрация и специфичность амплификата оцениваются электрофоретическим методом в 2% агарозном геле, напряжение 40 В в течение часа.
Амплифицированный фрагмент гена TLR представляет собой полосу, имеющую яркое, четко видимое свечение с длиной, указанной в таблице 1.
Таблица 1
Последовательность праймеров генов TLR крупного рогатого скота с учетом температуры отжига и длиной амлификата