Методические указания по количественному определению гистамина в рыбе с помощью тест-системы РИДАСКРИН Гистамин (RIDASCREEN® Histamin) (производство фирмы Ар-Биофарм/R-Biopharm, Германия)

     5. Сущность метода

В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Планшет, входящий в состав набора RIDASCREEN® Histamin, сенсибилизирован гистамином. Анализ выполняется следующим образом.

Исследуемые (стандартные) образцы и раствор, содержащий антитела к гистамину дозируются в лунки планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы гистамина, содержащегося в пробе (в стандартном растворе) и молекулы гистамина, адсорбированные на поверхности планшета, конкурируя между собой, взаимодействуют с внесенными антителами к гистамину.

После промывки планшета в лунки вносится раствор, содержащий вторичные антитела коньюгированные с пероксидазой, которые во время второй инкубации связываются комплексом гистамин - антитело на поверхности планшета. Несвязанные молекулы коньюгата удаляются при очередной промывке.

В лунки затем дозируется раствор субстрата (пероксид карбамида) и раствор хромогена (тетраметилбензидин). В процессе очередной инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы коньюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. Через определенное время развития цветной реакции, в результате которой бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре (ридере) при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации гистамина в исследуемых образцах.