Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" (утратило силу с 01.09.2021 на основании постановления Главного государственного санитарного врача РФ от 28.01.2021 N 4)
Приложение 19
Обработка и обеззараживание материала при проведении серологических и геннодиагностических исследований
Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) микроорганизмами I-II групп патогенности (бактериями, не образующими споры, хламидиями, риккетсиями и возбудителями глубоких микозов), проводится следующим способом:
- к исследуемому образцу добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01%) и прогревают его при 56°С в течение 30 мин. Затем 100 мкл образца переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинизотиоцианата, в объеме, указанном в инструкции по применению к набору реагентов, и инкубируют 15 мин при 65°С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.
Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) бактериями, образующими споры (возбудитель сибирской язвы), проводится следующим способом:
- исследуемый материал в количестве 0,1 мл засевают в пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера, рН 7,2 и инкубируют с аэрацией при 37°С в течение 2,5 ч. Добавляют пенициллин до конечной концентрации 1000 ед./мл и инкубируют при 37°С в течение 15 мин. После инкубации с пенициллином исследуемый материал прогревают на водяной бане в течение 10 мин при температуре 100°С. Затем 100 мкл обработанного образца переносят в пробирки объемом 1,5 мл и добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М гуанидинтиоизоцианата в объеме, указанном в инструкции по применению к набору реагентов, и инкубируют 15 мин при 65°С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.
Обработка исследуемого материала, инфицированного вирусом натуральной оспы, проводится следующим способом:
- материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 400 мкл лизирующего буферного раствора, содержащего 100 мМ Трис-НСI (рН=8,0), 100 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 1% SDS, и инкубируют 10 мин при температуре 65°С. Добавляют 50 мкл раствора протеиназы К (10 мг/мл), перемешивают и инкубируют в течение 1 ч при 56°С. Центрифугируют в течение 5 мин при 14000 об./мин для осаждения нерастворенных частиц. Супернатант переносят в стерильные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют равный объема смеси фенол/хлороформ (рН 8,0) и тщательно перемешивают. Затем центрифугируют в течение 5 мин при 10000 g. Переносят верхнюю водную фазу, содержащую раствор фенола и ДНК, в новую пробирку, добавляют 1/10 по объему 3 М ацетата натрия (рН 5,5), 30-40 мкг РНК-носителя (1 мкл раствора РНК-носителя с концентрацией 30-40 мкг/мкл) и равный объем изопропанола. Затем центрифугируют в течение 15 мин при 10000 g при 4°С. Полученный осадок промывают добавлением 1 мл 70% этанола и центрифугированием в течение 5 мин при 14000 об./мин при 40°С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.
Обработка исследуемого материала, инфицированного вирусами I-II групп патогенности (кроме вируса оспы), содержащего инфекционную (позитивную) РНК, проводится следующим способом:
- материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 500 мкл лизирующего буфера на основе 6 М гуанидинизотиоцианата и фенола (1:1) и инкубируют 20 мин при температуре 65°С. Затем выделяют РНК, используя метод нуклеосорбции на силикагеле, начиная с этапа добавления сорбента, либо метод осаждения РНК этанолом в присутствии 0,3 М ацетата натрия. Обратную транскрипцию выполняют в соответствии с инструкцией по применению к набору реагентов. Затем в образцы с кДНК добавляют РНКазу А до конечной концентрации 25 мкг/мл. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.
Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфицирование) вирусами I-II групп патогенности, содержащих неинфекционную (негативную) РНК или ДНК, проводится следующим образом:
- материал (100 мкл) помещают в пробирку объемом 1,5 мл, добавляют 500 мкл лизирующего буфера, на основе 6 М гуанидинизотиоцианата и фенола (1:1) и инкубируют 20 мин при температуре 65°С. После выполнения данных процедур материал считается обеззараженным.
Обработка исследуемого материала, подозрительного на инфицирование высокопатогенным неизвестным возбудителем, проводится в соответствии с обработкой материала, инфицированного бактериями, образующими споры, и (или) обработкой материала, инфицированного вирусом натуральной оспы.
Режим обеззараживания суспензий внутренних органов или костного мозга животных, материала от больных людей, субстратов гнезд птиц и млекопитающих, погадок хищных птиц, а также бактериальных взвесей определяется видом возбудителя. Обеззараживают возбудителей:
- чумы добавлением проверенного на бактерицидное действие формалина до 1-2%-й конечной концентрации с последующей экспозицией не менее 12 ч или до 4%-й концентрации с экспозицией при комнатной температуре в течение 1 ч;
- бруцеллеза и туляремии кипячением в течение 20 мин с последующим добавлением проверенного на бактерицидное действие формалина до 1-2% концентрации с последующим выдерживанием не менее 12 ч или до концентрации 4% с экспозицией при комнатной температуре в течение 1 ч;
- сапа и мелиоидоза добавлением формалина до 4%-й концентрации с последующей экспозицией в течение 12 ч;
- холеры кипячением в течение 30 мин;
- сибирской язвы кипячением в течение 60 мин с последующим добавлением формалина до 4%-й концентрации и экспозицией до 1 ч;
- глубоких микозов добавлением 10%-го раствора формалина с последующей экспозицией в течение 24 ч при комнатной температуре или в течение 2 ч при температуре (371)°С.