Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" (утратило силу с 01.09.2021 на основании постановления Главного государственного санитарного врача РФ от 28.01.2021 N 4)

Приложение 7     

Бактериологический метод контроля эффективности работы парового стерилизатора

1. Бактериологический контроль работы стерилизаторов проводят после монтажа и ремонта аппаратуры, а также в процессе его эксплуатации (плановый - 2 раза в год и при получении неудовлетворительных результатов контроля).

Контроль эффективности работы стерилизаторов осуществляют бактериологическим методом, используя биотесты на основании гибели спор тест-культуры.

Биотесты представляют собой флаконы из трубки стеклянной для лекарственных средств ФИ/1-5 НС 1 ТУ 64-0709-10-88 (инсулиновые флаконы) или чашечки из алюминиевой фольги (диск размером 14 мм с луночкой-вдавлением от неотточенного края карандаша), содержащие высушенные споры тест-культуры Вас. stearothermophilus ВКМ В-718, помещенные в пакеты из упаковочной бумаги (ОСТ 42-21-2-85). Упакованные тесты нумеруют и размещают в контрольные точки паровых стерилизаторов (5-10 тестов). По окончании стерилизации биотесты подвергают бактериологическому исследованию.

2. Штамм Вас. stearothermophilus ВКМ В-718 - подвижная термофильная палочка, по Граму окрашивается положительно, культивируется при температуре 551°С, исключающей развитие других широко распространенных микроорганизмов. Споры овальные, расположенные центрально. На мясопептонном бульоне (рН 7,30,1) через 24 часа образует помутнение среды, на мясопептонном агаре (рН 7,30,1) - слабо выпуклые колонии диаметром 2-4 мм с ровным краем. Штамм не патогенен для человека и животных. Штамм получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов института биохимии и физиологии микроорганизмов, хранится в музее культур НИИ дезинфектологии (117246, г.Москва, Научный проезд, 18).

Приготовление биотеста

В ампулу с лиофилизированной культурой вносят 0,2 мл стерильной водопроводной воды и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

Одну-две капли культуры засевают в 2 пробирки с бульоном (МПБ, Хоттингера, бульон питательный сухой) с 0,5% глюкозы. Суточную бульонную культуру засевают в пробирки на скошенный агар (Хоттингера, мясопептонный, сухой питательный). Для получения спор культуру, выращенную на твердой питательной среде, смывают 5 мл стерильной водопроводной воды и переносят во флаконы со скошенным картофельно-пептонным агаром. Взвесь покачиванием флакона равномерно распределяют по поверхности среды, инкубируют при 55°С в течение 10-12 суток в наклонном положении агаром вверх. Для создания достаточной влажности в термостат помещают открытые емкости с водой. На 7, 10 и 12 сутки культуру проверяют на интенсивность спорообразования. Достаточным количеством считают 80-90% спор в поле зрения. Культуру смывают стерильной дистиллированной водой. В целях освобождения от вегетативных клеток суспензию прогревают на водяной бане при температуре 65-70°С течение 30 мин, центрифугируют трехкратно с частотой вращения 33, 33с-1 (2000 об./мин) по 15 мин, промывая осадок стерильной дистиллированной водой после каждого центрифугирования. Отмытые споры суспендируют в стерильной дистиллированной воде в соотношении 1:1 по объему. Суспензию спор хранят в холодильнике при температуре 4°С в стерильных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками с резиновыми колпачками (срок хранения 2 года).

Чистоту культуры на всех этапах культивирования контролируют высевом на агаровые пластинки.

Для определения титра жизнеспособных спор 0,1 мл исходной суспензии десятикратно разводят до 10 стерильной дистиллированной водой, высевая на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл ориентировочно из 10-10 (предел разведения зависит от титра полученных спор). Посевы инкубируют в течение 48 часов, проводят подсчет выросших колоний. Титр жизнеспособных спор в исходной суспензии определяют как среднее арифметическое число колоний с учетом разведения исходной суспензии и объема пробы для посева.

Например, при посеве на три чашки Петри с агаром суспензии в разведении 1:100000 (10), подсчитано 140, 110 и 134 колонии. Аналогичные высевы из разведении 10 привели к образованию 12, 14 и 16 колоний; из 10 - 5, 3 и 7 колоний. Вычисляем общее число колоний, а затем среднее количество колоний для каждого разведения 128, 14 и 5.

Из расчета посевной дозы (0,1 мл на каждую чашку) вычисляем титр жизнеспособных спор в 1 мл исходной суспензии с учетом разведения, далее находим среднее арифметическое число колоний:

128·10·10=12,8·10;

14·10·10=14,0·10;

5·10·10=50,·10.

Таким образом, титр исходной суспензии составит:

(12·8+14,0+50,0) ·10:3=2,5·10 спор в 1 мл.

Исходная суспензия должна содержать не менее 2,5·10-2,5·10 спор в 1 мл. Споры в количестве 5·10-5·10 вносят из исходной суспензии с помощью дозатора пипеточного (ТУ 64-1-3329-81) в 0,02 мл в носители (стерильные инсулиновые флакончики с ватно-марлевой пробкой или чашечки из алюминиевой фольги, разложенные в чашки Петри), подсушивают в термостате при 37°С или в эксикаторе над осушителем (силикагель, хлористый кальций) при комнатной температуре в течение 24 часов.

Для определения фактической обсемененности исследуют не менее трех биотестов от каждой группы. Во флаконы (чашечки) вносят по 1,0 мл стерильной дистиллированной воды (чашечки из алюминиевой фольги, отмывают в широкогорлых пробирках с бусами в 10 мл) и встряхивают в течение 10 мин на аппарате для встряхивания жидкостей с последующим высевом на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл суспензии из трех последовательных десятикратных разведении.

3. Определение устойчивости спор тест-культур к действию водяного насыщенного пара под избыточным давлением проводят при температуре (1202)°С.

Биотесты в упаковочной бумаге помещают в стерилизационной коробке в камеру парового стерилизатора. После набора давления в водопаровой камере (0,110,01) МПа (1,10,1) кгс/см проводят продувку парового стерилизатора (вытеснение воздуха паром из камеры парового стерилизатора) в течение 10 мин при открытом спускном кране и давлении в стерилизационной камере от (0,01 до 0,02) МПа (от 0,1 до 0,2) кгс/см. После продувки доводят давление пара в стерилизационной камере до 0,11 0,01 МПа (1,1 0,1) кгс/см, температура (1202)°С и через 5 мин (времени выживания спор тест-культуры) с момента установления давления спускают пар. Для уменьшения времени воздействия пара до и после экспозиции подъем давления проводят максимум в течение 8 мин, спуск - в течение 3 мин.

Аналогичное исследование проводят в течение 15 мин времени выдержки (время гибели спор тест-культуры). Контроль температуры осуществляют максимальными термометрами. По окончании времени выдержки биотесты вынимают из стерилизатора и проводят бактериологическое исследование.

Партию биотестов считают годными для использования, если показатели устойчивости спор тест-культуры соответствуют вышеописанным требованиям.

4. Для определения эффективности работы стерилизатора в обеззараженные биотесты и контрольный тест (без стерилизации) стерильно вносят по 5 мл питательной среды, инкубируют при 55°С в течение 7 суток при ежедневном просмотре посевов, делая высевы на агаровые пластинки из проросших емкостей.

При использовании полусинтетической среды с индикатором феноловым красным рост тест-культуры определяют по изменению красного цвета среды (рН 7,70,1) на желто-оранжевый (рН 6,70,1) за счет разложения глюкозы с образованием кислоты.

В целях исключения ложного отрицательного результата (при наличии роста тест-культуры отсутствует изменение цвета питательной среды) флаконы (пробирки) должны быть плотно закрыты стерильными резиновыми пробками (N 7,5; 12,5).

Отсутствие роста тест-культуры указывает на эффективность работы стерилизатора. Рост других культур микроорганизмов относят за счет вторичного обсеменения.