Статус документа
Статус документа

МР 4.2.0114-16 Лабораторная диагностика внебольничной пневмонии пневмококковой этиологии

4. Биологические свойства Streptococcus pneumoniae, общая характеристика методов лабораторной диагностики


Возбудитель пневмококковой пневмонии, S. pneumoniae или пневмококк, входит в состав семейства Streptococcaceae, род Streptococcus, как вид условно-патогенных бактерий. Пневмококки - грамположительные каталазо- и оксидазоотрицательные мелкие шаровидные бактерии (кокки), являющиеся факультативными анаэробами.

При микроскопии часто имеют ланцетовидную форму, располагаются парами (диплококк), нередко имеют капсулу. Из жидких питательных сред под микроскопом визуализируются цепочками средней длины. При искусственном культивировании пневмококк нуждается в специальных питательных основах, обогащенных дефибринированной кровью животных. Рост возбудителя в искусственных условиях культивирования стимулирует повышенное содержание в атмосфере СО.

На плотных питательных средах пневмококк образует мелкие (1-2 мм в диаметре), округлые, блестящие, бесцветные колонии с ровным краем, мягкой консистенции, которые в большинстве случаев через 24 часа инкубации имеют сферическую форму с уплощенным центром, образующимся в результате аутолиза (шероховатая R-форма).

На 5%-м кровяном агаре вокруг колоний пневмококка характерно образование зеленящей зоны альфа-гемолиза. Наиболее вирулентные капсульные бактерии могут располагаться в виде капель росы, в последующем принимая сливной рост (мукоидная М-форма). Гладкие, компактные, точечные колонии (S-форма) преобладают у авирулентных штаммов.

Рост S. pneumoniae на жидких питательных средах характеризуется диффузным помутнением бульона без образования пленки.

Биохимическая активность пневмококка во многом совпадает с активностью других зеленящих стрептококков: он разлагает глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, не ферментирует маннит, салицин и сорбит, однако в отличие от других представителей зеленящих форм стрептококков не обладает способностью к росту при температуре 45°С.

Видовая специфичность пневмококка выражается в способности ферментировать инулин, чувствительности к оптохину и солям желчных кислот (дезоксихолату и таурохолату натрия). Вместе с тем в последние годы появились изоляты, устойчивые к оптохину (до 10% от всей популяции).

Вирулентность пневмококка в первую очередь обусловлена наличием полисахаридной капсулы, обеспечивающей антифагоцитарную активность, а также протеина адгезии, протеазы секреторного IgA, тейхоевой кислоты и фрагментов пептидогликана, активизирующих комплемент по альтернативному типу.

В зависимости от химического строения капсульного полисахарида выделяют более 90 серологических типов S. pneumoniae: серогруппы (обозначаются цифрами, например: серогруппа 6) и входящие в них серотипы (обозначаются буквами, например: серотип 6А). Определение серологических типов проводится с использованием серологических методик, основанных на реакции набухания капсулы в присутствии иммунной сыворотки или в реакции латкес-агглютинации. Альтернативным способом определения серогрупп (серотипов) является детекция специфических локусов бактериальной ДНК, вовлеченных в биосинтез капсульного полисахарида, с помощью различных ПЦР-методик или секвенирования ДНК.

Более 90% инвазивных заболеваний вызывается 23 серотипами возбудителя, которые входят в широко используемую в настоящее время полисахаридную вакцину (1, 2, 3, 4, 5, 6В 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 1-9F, 19А, 20, 22F, 23F, 33F).

Спектр антибиотикорезистентности пневмококка зависит от географического места изоляции и вида материала, из которого изолирован штамм (мазок из носоглотки, спинномозговая жидкость и др.). В России уровень устойчивости пневмококков, выделенных из нестерильных локусов, к пенициллинам (МПК>0,06 мг/л) составляет в среднем 11%, к макролидам - 7%, к тетрациклинам - 25%, к ко-тримоксазолу - 39%. Полирезистентностью (устойчивостью к 3 и более классам антимикробных препаратов) обладает 14,5% штаммов пневмококка, большинство из которых (>90%) выделено из респираторных образцов. Пневмококки 23-й, 19-й и 6-й серогрупп (серотипы 23F, 19F, 19А, 6В) часто характеризуются повышенной устойчивостью к пенициллину и другим антибактериальным препаратам, а также могут обладать полирезистентными свойствами, что обусловлено генетическими мутациями циркулирующих возбудителей.

Микроскопическое исследование относится к простым ускоренным методам обнаружения S. pneumoniae, позволяющим получить предварительный результат. Бактериоскопия окрашенного по Граму мазка определяет морфотип потенциального бактериального патогена. Ценность метода и решаемые задачи различаются в зависимости от того, из какого локуса организма отобран клинический материал.

Модифицированным вариантом микроскопии в комбинации с серологической диагностикой S. pneumoniae является метод Нейфельда или феномен набухания капсулы при взаимодействии с неразведенной специфической антипневмококковой сывороткой (I, II, lll типов) в присутствии синьки Лёффлера. Метод основан на способности капсул пневмококков увеличиваться в объеме в присутствии гомологичной антисыворотки, что регистрируют светооптической микроскопией. При положительном результате наблюдается резкое увеличение капсул пневмококков. При отрицательном результате капсулы едва заметны. Реакция набухания специфична и не дает положительного результата с другими капсульными бактериями, однако с его помощью невозможно идентифицировать не имеющие капсулы S. pneumoniae.

Пневмококки, имеющие капсулу, также можно визуализировать по методу Бурри-Гинса. По Бурри материал перемешивают с тушью, на фоне которой будут выделяться неокрашенные бактерии и капсулы. В модификации Гинса приготовленный по Бурри препарат дополнительно окрашивается фуксином Циля, при этом бактерии приобретают ярко малиновую окраску, а их капсулы остаются неокрашенными.

У пациентов, принимавших антибактериальные препараты, данные методы могут давать ложно-отрицательные результаты, поскольку в этом случае в клиническом материале могут присутствовать пневмококки, лишенные капсулы. Следует помнить, что при переходе S. pneumoniae из S в R-форму капсульные антигены утрачиваются.

Бактериологический метод позволяет выделить "чистую" культуру возбудителя, провести его видовую идентификацию и серотипирование, определить чувствительность к антимикробным препаратам.

Основной сложностью при выделении культуры пневмококка является требовательность к условиям культивирования и склонность микроорганизма к быстрому аутолизу (саморазрушению). Ограничением метода может быть сложность получения мокроты и значительная продолжительность исследования (результат определяется спустя 48-72 часа с момента забора биологического материала). Диагностическая ценность будет ниже при исследовании крови и широком использовании антимикробных препаратов на догоспитальном этапе (низкий уровень высеваемости).

Отправной точкой идентификации пневмококков на кровяном агаре является гемолитическая реакция стрептококков. S. pneumoniae - гемолитический (зеленящий) стрептококк, который по морфологическим признакам роста трудно отличим от идругих гемолитических ("зеленящих") стрептококков - S. mitis, S. oralis, S. sanguis, S. parasanguis, S. gordonii.

Признаками, подтверждающими видовую принадлежность изолята, являются его морфология (грамположительные кокки), отсутствие каталазо- и оксидазообразования, чувствительность к оптохину и лизис солями желчи. Оптохин (этилгидрокупреина гидрохлорида) селективно подавляет рост пневмококка в отличие от других "зеленящих" стрептококков. Соли желчи (в особенности дезоксихолат натрия и таурохолат натрия) обладают способностью избирательно лизировать колонии S. pneumoniae на агаре или в бульоне. Метод основан на активации пневмококковых аутолизинов - ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки, что приводит к визуальному лизису S. pneumoniae в течение 0,5-2 ч. Однако примерно для 14% пневмококков наблюдается неполный лизис. Дифференциальная диагностика S. pneumoniae проводится с прочими представителями рода Streptococcus: S. pseudopneumoniae (чувствительного к оптохину, но устойчивого к желчи), S. pyogenes группы А (чувствительного к бацитрацину и положительного в ПИРА-тесте), S. agalactiae группы В (положительного в тесте с гиппуратом Na и САМР-тесте), зеленящими стрептококками группы S. viridans (как правило, растущих в тиогликолевой среде при температуре 45°С). От представителей других родов: Neisseria spp., Haemophilus spp. и Corynebacterium spp., дающих схожий рост на средах первичного посева с атипичными формами пневмококков, их отличают морфология, оксидазная и каталазная активность.

Необходимо помнить, что в современной популяции до 10% изолятов пневмококков устойчивы к оптохину, они также резистентны и к бета-лактамным антибиотикам. В то же время рост некоторых "зеленящих" стрептококков подавляется оптохином.

Принадлежность S. pneumoniae, устойчивых к оптохину, необходимо подтверждать с использованием комплекса тестов, дифференцирующих между собой различные виды стрепрококков, с помощью тест-систем коммерческого производства, разрешенных к применению в Российской Федерации.

К сожалению, один из современных методов идентификации бактерий по белковому профилю, MALDI-масс-спектрометрия, не может быть использован для идентификации S. pneumoniae в связи с высоким сходством белкового профиля различных видов гемолитических стрептококков.

Конечным этапом бактериологической диагностики S. pneumoniae является определение чувствительности к антибиотикам. В настоящее время теоретически обоснованным считается подход к оценке чувствительности, предлагаемый Европейским сообществом (European on Antimicrobial Susceptibility Testing - EUCAST), основанный на признании факта существования различий между микробиологической и клинической чувствительностью/устойчивостью микроорганизмов. Для обоснования клинических критериев EUCAST использует фармакокинетические/фармакодинамические закономерности зависимости между величиной МПК антибактериального препарата в отношении микроба-возбудителя, фармакологическими характеристиками препарата и эффективностью лечения.

К способам обнаружения антигена пневмококка с целью его ускоренного выявления может быть отнесен метод латекс-агглютинации, основанный на выявлении пневмококковых капсульных полисахаридных антигенов с применением поливалентной специфической пневмококковой сыворотки. Антиген, содержащийся в исследуемом образце, взаимодействует со специфичными гомологичными антителами, которыми покрыты латексные частицы. В присутствии гомологичного антигена латексные частицы агглютинируют. В отсутствии антигена, они остаются в виде гомогенной суспензии.

Исследование проводят непосредственно с чашки первичного посева. Можно использовать сам биологический материал, как правило, ликвор или сыворотку крови. Быстроту получения результата и простоту теста могут нивелировать перекрестные реакции с антигенами других стрептококков. К преимуществам метода относят быстроту и простоту исполнения, к недостаткам - высокую стоимость, невозможность определения антигена в нестерильном биологическом материале.

В последние годы все большую популярность приобретают быстрые тесты "у постели больного", в частности иммунохроматографический экспресс-тест для выявления пневмококкового клеточного полисахарида (с-полисахарида) в моче.

Тест адаптирован только для образцов мочи взрослых пациентов и применяется до начала антибактериальной терапии. Не рекомендуется проводить данное исследование среди лиц, ранее перенесших внебольничную пневмонию или получивших профилактическую прививку от S. pneumoniae в течение 5 дней, предшествующих тестированию. Время выполнения исследования составляет 15 минут, чувствительность теста, по данным литературы, - 86-90%, специфичность - 71-97%.

Ряд международных сообществ рекомендует этот метод в качестве дополнительного способа диагностики пневмококковых пневмоний, прежде всего у пациентов с тяжелым течением заболевания. Диагностическая значимость теста снижается в популяциях с высоким носительст- вом пневмококков S. pneumoniae и S. mitis. Отрицательный результат теста не исключает наличия пневмококковой инфекции.