При конструировании препаратов используют вирулентные фаги природного происхождения. Исходной субстанцией лечебно-профилактических бактериофагов являются стерильные фильтраты фаголизатов соответствующих видов бактерий. Дополнительными методами очистки должно быть обеспечено их освобождение от продуктов жизнедеятельности бактерий, эндо- и экзотоксинов, продуктов фаголизиса бактериальных клеток. Очищенные концентрированные фаголизаты подлежат соответствующим технологическим процедурам в зависимости от вида конечного препарата (моно- или комбинированный) и его лекарственной формы. В состав препарата должны входить несколько штаммов (не менее 2-3) вирулентных фагов, биологические свойства каждого из них должны быть охарактеризованы.
2.1.1. Характеристика биологических свойств фаговых штаммов, включенных в состав лечебно-профилактического препарата бактериофагов.
Бактериофаги должны иметь строго литический инфекционный цикл. Наиболее полной характеристикой, позволяющей всесторонне оценить наличие генов перехода в лизогенный цикл, факторов вирулентности и токсинов, является определение полной последовательности генома бактериофага.
Экспериментальными признаками такой классификации могут служить определение морфологии вирусной частицы с помощью электронной микроскопии негативного контрастирования и ПЦР-типирование по наиболее консервативным генам, характерным для данной группы бактериофагов.
Каждый из фаговых штаммов, используемых в препарате, должен:
демонстрировать высокую специфическую литическую активность, выявляемую путем титрования в жидкой питательной среде по методу Аппельмана;
иметь высокую концентрацию (количество бляшкообразующих единиц в 1 мл), определяемую методом агаровых слоев по Грациа;
обладать широким диапазоном литического действия на представительной коллекции бактериальных штаммов, музейных и изолированных от больных;
быть изучен с помощью молекулярно-генетических методов (полногеномного секвенирования) для определения его полной нуклеотидной последовательности ДНК с последующим биоинформационным анализом;
быть морфологически охарактеризован с помощью электронной микроскопии негативного контрастирования, что позволяет соотнести de novo выделенный бактериофаг с известными группами фагов, которые заведомо относятся к литическим и пригодным для терапевтического применения.
Другими характеристиками, которые должны быть определены для каждого фагового штамма, являются:
частота генерации фагоустойчивых форм;
длительность латентного периода в ходе инфекции;
урожайность и величина выхода фаговых частиц из одной инфицированной бактериальной клетки.
Кроме того, должна быть представлена характеристика бактериального штамма, на котором проводится культивирование бактериофага. Штамм не должен содержать легко индуцируемых профагов, загрязняющих препарат. Оценку наличия индуцируемых профагов проводят путем обработки бактерий индукторами (ультрафиолетовым излучением, митомицином С, налидиксовой кислотой) с последующим контролем появления бляшек лизиса, вызванного активацией умеренных бактериофагов, содержащихся в геноме бактерии.
2.1.2. Характеристика основных биологических свойств лечебно-профилактических препаратов бактериофагов.
Представленные материалы на препарат в целом, помимо характеристик на отдельные фаги, должны содержать следующую информацию:
специфическая литическая активность, определяемая по методу Аппельмана с использованием соответствующих бактериальных тест-штаммов (контрольных штаммов). Тест-штаммы (не менее 10), типичные по своим морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, не должны быть использованы при изготовлении препарата. Активность бактериофага, определяемая по методу Аппельмана, выражается отрицательным десятичным логарифмом, указывающим последнее разведение бактериофага в жидкой питательной среде, в которой рост бактериальной культуры визуально не наблюдается;
диапазон действия изучаемого препарата в отношении соответствующих ему видов бактериальных возбудителей инфекций, выделенных от больных (не менее 70 процентов фагочувствительных штаммов), циркулирующих в современных условиях на территориях государств-членов (не менее 3-х регионов);
стабильность препарата. Активность препаратов бактериофагов должна сохраняться в течение всего заявленного срока годности при регламентированной температуре хранения. Определение стабильности препарата (способности сохранять литическую активность бактериофага) проводится по методу Аппельмана.
При проведении исследования антимикробного действия бактериофагов необходимо обеспечение следующих условий, гарантирующих достоверность результатов:
питательные среды для культивирования бактерий, на которых изучается антимикробное действие бактериофага, должны отвечать требованиям стандартности и воспроизводимости результатов;
стандартность бактериальной нагрузки (посевной дозы) штаммов-мишеней для изучаемого бактериофага.