Нежелательная иммуногенность биологических лекарственных препаратов может проявляться в виде гуморального и клеточного иммунного ответа. Поэтому важно выбрать и (или) разработать методы и методологию оценки такого иммунного ответа. Основное внимание исследователей, как правило, направлено на выявление антител и их характеристику, поскольку это технически выполнимо и имеет большое значение для определения клинической значимости в плане безопасности и эффективности применения лекарственного препарата. Вместе с тем, клеточный иммунитет может также играть большую роль, заявитель должен рассматривать необходимость его оценки в индивидуальном порядке.
4.3.1. Стратегия количественного определения.
Выбор подходящей стратегии для оценки нежелательной иммуногенности биологических лекарственных препаратов имеет ключевое значение. Обычно стратегия должна включать в себя методы скрининга для идентификации образцов (пациентов) с наличием исследуемых антител, аналитические иммунохимические методы для подтверждения наличия антител и определения их специфичности и ряд функциональных методов для оценки нейтрализующей способности выявленных антител. Кроме того, необходимо предусмотреть другие аналитические методы, не направленные на выявление антител, например, методы определения имеющих значимость биомаркеров или фармакокинетических параметров (если применимо), которые позволят оценить и охарактеризовать влияние антител (других показателей иммунного ответа, если таковые выявлены (индуцированы)) на клинические эффекты. В соответствующих случаях у всех пациентов необходимо собирать исходные данные.
В приложении N 2 к настоящей главе приведен пример возможной стратегии выявления и установления характеристик антител.
4.3.2. Количественное определение антител.
Скрининговые методы количественного определения. Скрининговые методы количественного определения должны позволять обнаруживать антитела, выработанные в ответ на введение биологического лекарственного препарата, у всех серопозитивных пациентов (то есть во всех серопозитивных образцах). Следует учитывать, что неизбежно появление ложноположительных результатов, поскольку обычно абсолютной специфичности любого скринингового метода достичь невозможно, но вместе с тем ложноотрицательных результатов быть не должно. Желательными характеристиками скрининговых методов количественного определения являются чувствительность, специфичность, прецизионность, воспроизводимость и устойчивость.
Методы, подтверждающие наличие антител. Такие методы необходимы для исключения ложноположительных образцов (пациентов), отобранных в результате скрининга. Для этой цели могут быть использованы разные подходы, но при выборе метода следует учитывать ограничения и характеристики методов скрининга. Простое повторение скринингового метода количественного определения в его оригинальной форме для подтверждения специфичности, как правило, недостаточно и нецелесообразно.
Методы градации специфичности антител. В некоторых случаях необходимо использовать дополнительные методы, позволяющие получить подтверждающую информацию о специфичности выявленных антител. Эти данные способствуют подтверждению специфичности иммунного ответа.
Методы определения нейтрализующей активности. Для оценки нейтрализующей способности антител обычно используют биологические методы. При этом необходимо выбрать или разработать такой метод, который бы наилучшим образом соответствовал биологическому лекарственному препарату. Количественное определение с использованием биологического метода, применяемого для определения специфической активности (например, при определении качества серии при ее выпуске) как правило, можно использовать и для анализа нейтрализующих антител. Однако для оптимального определения нейтрализующей способности используемая методика зачастую требует доработки. При невозможности (недоступности) нейтрализующих методов количественного определения на основе клеток, допускается использовать методы конкурентного связывания с лигандом или другие альтернативы. Однако при их использовании необходимо подтвердить, что данные методы отражают нейтрализующую способность (активность) исследуемых антител.
4.3.3. Валидация методик.
Валидация аналитической методики является непрекращающимся процессом на протяжении всей разработки препарата. В целях проверки возможности достижения поставленных целей используемые в основных (опорных) исследованиях методики требуют валидации. С помощью валидационных исследований необходимо подтвердить, что методики достаточно линейны и дают концентрационно-зависимые отклики на изучаемые аналиты, а также имеют достаточную правильность, прецизионность, чувствительность, специфичность и устойчивость. Во избежание межлабораторной вариабельности в рамках основных (опорных) клинических исследований предпочтительным является использование централизованной лаборатории. На пострегистрационном этапе также необходимо учитывать потенциальную межлабораторную вариабельность.
Валидацию также необходимо проводить для подтверждения того, что эффект матрицы, обусловленный реактивами или веществами, содержащимися в образцах, не влияет негативным образом на полученные результаты. Это можно осуществить путем проведения исследований восстановления (recovery) и наблюдения за влиянием таких веществ, содержащихся в матрице, на ответ, полученный в отсутствие их влияния. Подобное исследование необходимо провести в отношении всего диапазона разведений проб, используемых в анализах, и, по меньшей мере, в некоторых случаях в отношении предельных разведений, которые можно достоверно оценить.
Остаточное содержание биологического препарата в крови пациента может образовывать комплексы с антителами к нему и вследствие этого снижать поддающуюся обнаружению концентрацию антител. Данное обстоятельство может различным образом влиять на методику в зависимости от ее разновидности, формата и типа антител. Существует несколько подходов к решению указанной проблемы, например, диссоциация иммунных комплексов кислотой, удаление избыточного количества биологического препарата путем твердофазной абсорбции, использование длительного периода инкубации и (или) использование методики, позволяющей проводить анализ в высоких разведениях. Сами подходы также подлежат валидации на применимость. Решение об их использовании принимается в индивидуальном порядке. В некоторых случаях указанную проблему можно преодолеть, осуществляя отбор проб для оценки профиля антител спустя достаточное количество времени после введения препарата, что позволяет ему элиминироваться из кровотока до отбора проб. Однако такой подход не должен значительно усложнять процесс обнаружения антител и лечение пациента.
Стандартизация и контроли. Аналитические методики необходимо стандартизовать, это требует подбора и (или) разработки соответствующих стандартных материалов, то есть использования соответствующих биологических стандартов и (или) хорошо описанных положительных и отрицательных контролей. Эти реактивы являются ключевыми для методики и необходимы для ее калибровки (градуировки) и валидации. Стандартизация особенно важна для методик, используемых при изучении нежелательной иммуногенности, поскольку она тесно связана с интерпретацией результатов анализа и дифференциацией между серопозитивными и серонегативными образцами.
4.3.4. Установление характеристик антител к терапевтическому белку.
При обнаружении у пациентов, получающих лечение, индуцированных антител необходимо установить их клиническую значимость. К этим исследованиям относятся иммунологическая и (или) биологическая оценка характеристик антител, а также изучение их влияния (других проявлений индуцированного иммунного ответа) на действие лекарственного препарата. Некоторые исследования могут быть проведены без использования анализа антител в рамках исследований in vitro, однако при таком подходе может потребоваться клиническое обследование пациентов, получающих лечение.
Установление характеристик антител. Если у пациента индуцирована выработка антител, образцы сыворотки или плазмы необходимо охарактеризовать с точки зрения содержания антител (концентрации (титра)), их нейтрализующей способности и других критериев, определяемых в каждом отдельном случае в зависимости от свойств биологического лекарственного препарата, целей исследования, особенностей пациентов, клинической симптоматики и других факторов. К ним могут относиться необходимость определения класса и подкласса (изотипа) иммуноглобулинов, аффинность и специфичность антител. В зависимости от цели исследования и этапа разработки препарата объем установления характеристик может быть различным. Используемые методики должны соответствовать своему целевому назначению.
Антитела, присутствие которых в положительных образцах подтверждено, должны быть исследованы в отношении их специфичности к действующему веществу (белковому компоненту), а также, если возможно, дифференцированы от антител, связывающихся с родственными и производственными компонентами. Известно, что антитела могут вырабатываться против всех и (или) любого из указанных веществ. Также желательно изучить перекрестную реактивность антител с другими лекарственными препаратами, содержащими сходные белки, и с их эндогенными аналогами (если это возможно и применимо).
Необходимо оценить нейтрализующую способность антител, обнаруженных в сероположительных образцах, поскольку обычно этот показатель коррелирует со снижением клинической эффективности биологического лекарственного препарата. В некоторых случаях имеет значение скрининг нейтрализующих образцов на наличие перекрестной нейтрализующей способности других лекарственных препаратов, содержащих такой же белок, или нейтрализации эндогенного белка, поскольку это может влиять на клиническую эффективность и безопасность применения исследуемого лекарственного препарата. Следует отметить, что нейтрализующая активность не обязательно соотносится с содержанием связывающих антител, т. е. образцы с высоким содержанием связывающих антител могут оказывать слабое нейтрализующее действие на биологическую активность, тогда как образцы с низким содержанием связывающих антител могут обладать различной степенью нейтрализующей способности (в зависимости от образца), которая зависит от вида лекарственного препарата и требует экспериментального изучения.
Стратегия оценки иммуногенности: дизайн и интерпретация. До начала оценки результатов клинических исследований необходимо тщательно и заранее продумать дизайн исследований иммуногенности, чтобы удостовериться, что в них включены все обязательные процедуры, а именно: выбор, оценка и установление характеристик аналитических методик, определение надлежащего режима отбора образцов, их объем, пробоподготовка и хранение, выбор статистических методов анализа данных. Это требуется в отношении методик, используемых для определения содержания антител и установления их характеристик, а также методов оценки клинического ответа в ответ на выработку антител (если они образуются). Указанные показатели необходимо определять в индивидуальном порядке, с учетом особенностей лекарственного препарата, пациентов и ожидаемых клинических параметров. Эти исследования могут быть источником ценной информации о наличии высокой иммуногенности к биологическим препаратам, ее свойствах и потенциальных клинических последствиях. Они необходимы при изучении сравнительной иммуногенности биоаналогичных (биоподобных) препаратов и изменении процесса производства зарегистрированных препаратов. Однако нежелательная иммуногенность может не обнаруживаться в рамках исследований, проводимых на предрегистрационном этапе, в силу ограниченного количества пациентов, в них участвующих. При этом необходимо продолжать оценку иммуногенности и ее клинический последствий на пострегистрационном этапе в рамках фармаконадзора. В некоторых случаях в целях оценки риска, обусловленного нежелательным иммунным ответом, необходимы пострегистрационные клинические исследования.
Дополнительные подробности о методах оценки и описания иммуногенности приведены в приложении N 1 к настоящей главе.