Примеры испытаний на наличие вирусов
Испытания | Исследуемый материал | Способность к обнаружению | Ограничения к обнаружению |
Образование антител | лизат клеток и их культуральная среда | специфичные вирусные антигены | антигены, не инфекционные для животной тест-системы |
Скрининг вируса in vivo | лизат клеток и их культуральная среда | широкий спектр вирусов, патогенных для человека | возбудители, которые не реплицируются или не вызывают заболеваний в тест-системах |
Скрининг вируса in vitro для: | широкий спектр вирусов, патогенных для человека | возбудители, которые не способны к репликации или не вызывают поражений в тест-системах | |
1) характеристики Банка клеток | лизат клеток и их культуральная среда (при совместном культивировании исследуемый материал должен содержать интактные клетки) | ||
2) скрининга производства | сбор необработанного продукта или лизат клеток и их культуральные среды из промышленного реактора | ||
Трансмиссионная электронная микроскопия на: | вирус и вирусоподобные частицы | качественный анализ с оценкой идентичности | |
1) клеточном субстрате | жизнеспособные клетки | ||
2) супернатанте клеточной культуры | бесклеточный супернатант культуры | ||
Обратная транскриптаза (RT) | бесклеточный супернатант культуры | ретровирусы и экспрессированная ретровирусная обратная транскриптаза | определяет только ферменты с оптимальной активностью при предпочтительных условиях, интерпретация может представлять сложность в связи с наличием клеточных ферментов, фона в некоторых концентрированных образцах |
Инфицирующая способность ретровирусов (RV) | бесклеточный супернатант культуры | инфекционные ретровирусы | ретровирусы, не способные реплицироваться или не формирующие дискретные очаги или бляшки в выбранной тест-системе |
Совместное культивирование | жизнеспособные клетки | инфекционные ретровирусы | ретровирусы, не способные реплицироваться |
1) конечная точка инфицирующей способности | ретровирусы, не способные реплицироваться или не формирующие дискретные очаги или бляшки в выбранной тест-системе | ||
2) конечная точка трансмиссионной электронной микроскопии | качественный анализ с оценкой идентичности | ||
3) конечная точка обратной транскриптазы | определяет только ферменты с оптимальной активностью при предпочтительных условиях. Интерпретация может представлять сложность в связи с наличием клеточных ферментов, фона в некоторых концентрированных образцах | ||
ПЦР | клетки, культуральная жидкость и прочие материалы | специфичные последовательности вируса | должны присутствовать праймеры, не определяет инфицирующую способность вируса |
Поскольку большинство используемых методик может изменяться с учетом научного прогресса, возможно использование альтернативных подходов при наличии данных, обосновывающих их применение. Производителям рекомендуется обсуждать такие альтернативные подходы с уполномоченными органами государств-членов. В отдельных ситуациях может потребоваться проведение других испытаний. Испытания должны включать в себя надлежащие контрольные материалы, гарантирующие достаточную чувствительность и специфичность. Во всех случаях, когда по виду животного - источнику происхождения клеточного субстрата - можно с относительно высокой вероятностью выявить наличие определенного вируса, может потребоваться проведение специальных испытаний и (или) применение других подходов. Если используемая в производстве клеточная линия получена от человекообразных или нечеловекообразных обезьян, необходимо дополнительно (при отсутствие должного обоснования) проверить ее на наличие таких вирусов человека, как вирусы, вызывающие иммунодефициты или гепатиты. Для выявления последовательностей нуклеиновых кислот, характерных для этих и других специфичных вирусов, может использоваться ПЦР. Далее представлено краткое описание общих принципов положений, в соответствии с которыми производитель должен обосновать свои действия.
3.B.1. Испытания на наличие ретровирусов.
При испытании клеток ГБК и клеток, культивируемых до предельного для производства клеточного возраста in vitro и дольше, следует проводить испытания на наличие ретровирусов, включая оценку инфицирующей способности на чувствительных клеточных культурах и электронную микроскопию. Если инфицирующая способность не выявлена и при помощи электронной микроскопии не были обнаружены ретровирусы или ретровирусоподобные частицы, проводятся исследования с использованием обратной транскриптазы или другие подходящие испытания на ретровирусы, которые могут не иметь инфицирующей способности. Исследования индукции в данном случае неэффективны.
3.B.2. Исследования in vitro.
Исследования in vitro проводятся путем инокуляции исследуемого материала, указанного в таблице 2, в разные восприимчивые индикаторные клеточные культуры, что позволяет определять большое число вирусов человека и животных. Выбор клеток для испытаний определяется видами животных, из которых получен подлежащий испытанию банк клеток, при этом необходимо включить клеточные линии человекообразных или нечеловекообразных обезьян, чувствительные к вирусам человека. Метод и материал для исследования выбираются в зависимости от типа вируса, наличие которого в материале предполагается с учетом происхождения клеток и проведенных с ними манипуляции. Необходимо проводить выявление как цитопатических, так и гемадсорбирующих вирусов.
3.B.3. Исследования in vivo.
Для выявления некультивируемых вирусов (не растущих в клеточных культурах) исследуемый материал, указанный в таблице 2, вводится животным, включая новорожденных и взрослых мышей, а также в развивающиеся эмбрионы птиц. В зависимости от происхождения исследуемых клеточных линий возможно проведение исследований на других видах животных. Следует контролировать состояние здоровья опытных животных, и любые отклонения от нормы нужно исследовать с целью установления причины заболевания.
3.B.4. Испытания на образование антител.
Видоспецифичные вирусы, присутствующие в клеточных линиях грызунов, можно выявить путем инокуляции исследуемого материала, указанного в таблице 2, не зараженным вирусом (безвирусным) животным с последующим определением сывороточных антител или ферментативной активности, проявляющихся спустя определенное время. В качестве примера можно привести тесты продукции мышиных (MAP), крысиных (RAP) и хомячьих (HAP) антител. Перечень вирусов, для выявления которых проводятся испытания продукции антител, приведен в таблице 3.