Методические указания по применению унифицированных методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам

1.1.1. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков

Принцип. На поверхность питательного агара в чашках Петри, засеянного испытуемыми микробами, наносят бумажные диски, пропитанные антибиотиками, и чашки инкубируют при 37°С. Наличие зоны задержки роста микробов вокруг дисков свидетельствует о чувствительности возбудителя к препарату, отсутствие зоны задержки роста - об устойчивости.

Компоненты.

1. Диски. Для исследования могут быть использованы только стандартные заводские диски. Во флаконах с дисками, пропитанными нестойкими к влаге антибиотиками, находится силикагель, который является хорошим влагоуловителем и показателем влажности во флаконе (при увлажнении силикагель меняет свою окраску с синей на розовую). Диски из флаконов, в которых силикагель окрашен в коричневый или розовый цвет, не используются. Диски хранят в сухом темном месте при температуре не выше 20°С. После вскрытия флакона дисками можно пользоваться не более месяца.

2. Питательные среды.

а) Среда на переваре Хоттингера с содержанием 120-140 мг% аминного азота, 1-2% агара, pH 7,2-7,4.

б) Казеиново-дрожжевая среда с таким же содержанием аминного азота и агара и значением pH.

в) Мясо-пептонная среда с таким же содержанием агара и pH.

В случае необходимости в среду может быть добавлено 5% крови или сыворотки, что отрицательного влияния на результаты анализа не оказывает.

Ход определения. В стерильные чашки Петри диаметром 100 мм, расположенные на горизонтальной поверхности, наливают 20 мл расплавленного питательного агара. Перед посевом поверхность среды должна быть подсушена для того, чтобы посевной материал мог легко всасываться. В качестве посевного материала может быть использована суточная бульонная культура (при интенсивном росте допускается использование 4-5-часовой культуры, при медленном росте - 2-3-суточной культуры) или 1-млрд-суспензии, приготовленной с агаровой культуры. 1 мл бактериальной взвеси наносится на поверхность агара и равномерно распределяется путем покачивания чашки с последующим отсасыванием избытка жидкости пипеткой.

В тех случаях, когда допускается постановка теста с испытуемым материалом (гной, раневое отделяемое и др.), последний наносят на поверхность питательного агара и равномерно растирают по поверхности среды стерильным шпателем. Одновременно исследуемый материал засевают для выделения чистой культуры и последующей постановки теста с чистой культурой. При монокультуре исследование можно не повторять.

Чашки подсушивают в течение 30-40 минут при комнатной температуре. Затем на поверхность засеянной среды пинцетом накладывают диски, пропитанные различными антибиотиками. В каждой чашке может быть испытано действие нескольких антибиотиков (до 5-6). Диски накладывают на поверхность агара плотно для тесного контакта со средой, следя за тем, чтобы не были положены 2 сцепленных между собой диска. Диски размещают на равном расстоянии один от другого и примерно на 2 см от края чашки. Чашки ставят в термостат перевернутыми кверху дном или вкладывают под крышку чашки кружок фильтровальной бумаги, чтобы избежать размывания газона конденсационной водой, и инкубируют при 37°С в течение 18-ти часов. Если исследуемый вид микроорганизмов растет медленно, инкубацию продлевают до 48-72 часов или более, в зависимости от появления роста в контроле.

Оценка результатов. С помощью линейки или измерителя и миллиметровой бумаги определяют диаметр зон задержки роста микробов вокруг дисков, включая диаметр самого диска. Единичные колонии или тонкая пленка роста микроорганизмов внутри зоны задержки роста не учитывают. Отсутствие зон задержки роста микробов вокруг дисков указывает на отсутствие чувствительности микроба к данному антибиотику. При зоне задержки роста микроба диаметром до 10 мм штамм расценивается как мало чувствительный. Зона задержки роста микроба более 10 мм указывает на чувствительность штамма. Чем больше зона задержки роста, тем выше чувствительность микроорганизмов к антибиотику. В ответе должно быть написано, какой чувствительностью обладает исследуемая культура, а не размер зоны задержки роста.