Генотипические методы определения лекарственной чувствительности/устойчивости МБТ основаны на изучении специфических участков генома МБТ и выявлении наличия или отсутствия определенных мутаций в генах, связанных с резистентностью к конкретным ПТП. При этом исследованию могут подвергаться как диагностический материал, так и выросшие культуры микроорганизмов.
Основным достоинством молекулярно-генетических методов (МГМ) является быстрое и достоверное выявление больных МЛУ ТБ, так как они позволяют выявить ЛУ МБТ к рифампицину и изониазиду, а также к важнейшим препаратам второго ряда, позволяя использовать разделение потоков больных и включать в режим лечения наиболее эффективные препараты.
Использование МГМ для определения ЛУ является первоначальным этапом обследования больных и не исключает применение традиционных культуральных методов определения ЛЧ возбудителя, т.к. молекулярно-генетические тест-системы определения ЛУ в настоящее время разработаны не для всех ПТП и диагностическая чувствительность их в некоторых случаях недостаточная для назначения корректного режима лечения.
Молекулярно-генетические тест-системы определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза представлены тремя основными технологиями:
1. Гибридизационные технологии, основанные на гибридизации продуктов ПЦР со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизированными на матрице, которая может представлять собой биологический микрочип, или ДНК-стрип;
2. Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени;
3. "Картриджная" технология (выделение ДНК и амплификация идут автоматически в специальном картридже).
6.1. Гибридизационные технологии.
Гибридизационные технологии позволяют в культуре с плотной или жидкой среды или непосредственно в мокроте, положительной по результатам микроскопического исследования, в течение 1-2 дней выявлять наиболее распространенные мутации в генах МБТ, связанных с устойчивостью к основным ПТП первого ряда - изониазиду и рифампицину и некоторым ПТП второго ряда (в зависимости от тест-системы).
Данная группа методов основана на том, что амплифицированные в результате ПЦР целевые последовательности гибридизуются с зондами, нанесенными на соответствующую матрицу. По результатам гибридизации делается вывод о наличии мутаций, влекущих устойчивость к ПТП.
6.2. Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени.
Метод ПЦР в режиме реального времени позволяет определять мутации, ассоциированные с ЛУ к рифампицину, изониазиду. Преимуществом данного метода перед описанными выше является отсутствие этапа гибридизации и оценка результатов в режиме реального времени, что позволяет снизить возможность кросс-контаминации образцов. Однако, для получения информации, сравнимой с гибридизационными технологиями, необходимо проведение большего числа циклов анализа. Использование зарегистрированных наборов позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью (94% и 99%, соответственно) выявлять мутации в генах rpoB, katG и inhA, ассоциирующиеся с устойчивостью к рифампицину и изониазиду.
6.3. Картриджная технология.
Использование этой системы позволяет непосредственно из нативной мокроты в очень короткие сроки (в течение 2,5 часов) одновременно проводить выявление ДНК МБТ и с высокой достоверностью определять устойчивость МБТ к рифампицину.
Указанный метод прост в применении и обладает хорошими диагностическими характеристиками, позволяя получить своевременные и достоверные данные для клинического и эпидемиологического использования.