Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений (не действует на территории РФ на основании приказа Минздрава России от 24.08.2020 N 889)
Ход микробиологического исследования
Первый день.
Выделение гемофильных микробов из материалов от больных и их идентификацию следует проводить по этапам.
Бактериоскопический метод: мазки из исследуемого материала или культуру, окрашенные по Граму, просматривают под микроскопом с иммерсией. Обнаружение в мазках мелких палочек, равномерно окрашенных в бледно-красный цвет, позволяет заподозрить наличие в исследуемом материале гемофилов.
Культуральный метод: исследуемый материал засевают бактериологической петлей на чашку с кровяным или шоколадным агаром. Кровь, посеянную на жидкие питательные среды, термостатируют при 37°C в атмосфере с 5%-10% CO, полученной в эксикаторе с зажженной свечой.
Второй день.
На агаре с нативной кровью (5%-10%) гемофилы растут в виде чрезвычайно мелких полупрозрачных колоний (диаметр 0,5 мм и менее), не имеющих характерных особенностей, их трудно дифференцировать от колоний других видов бактерий.
На шоколадном агаре гемофилы растут в виде полупрозрачных, сероватых, нежных, сочных колоний диаметром от 1 до 2 мм; в зависимости от состояний популяции могут формировать три вида колоний: крупные, круглые слизистые колонии (M-форма); круглые, полупрозрачные голубоватые колонии размером до 1 мм (S-форма); очень мелкие, менее 1 мм в диаметре, непрозрачные колонии (R-форма). В мазках из M- и S-колоний, окрашенных по Граму, видны мелкие грамотрицательные палочки; для R-форм характерен полиморфизм, встречаются и нитевидные формы. При окраске тушью по Гинсу у M- и S-форм вокруг клеток видна капсула, хорошо выраженная у M-форм и небольшая у S-форм. При росте на шоколадном агаре культура H. influenzae обладает "мышиным" запахом, что является одним из характерных признаков этой группы микробов.
Для накопления биомассы, необходимой при идентификации культур по биохимическим тестам, после микроскопирования подозрительные колонии отсевают штрихом в пробирки на шоколадный агар.
Одновременно проводят повторный высев подозрительных колоний на питательный агар без крови и дрожжевых добавок. Посевы помещают в термостат при 37°C на 18-24 часа.
Отсутствие роста культуры на питательном агаре без крови и обнаружение в мазках из колоний, выросших на шоколадном агаре, мелких грамотрицательных палочек с капсулой или без нее, является первым этапом подтверждения выделения одного из видов гемофильных микробов.
При росте на шоколадном агаре большого числа однотипных колоний культуру можно изучить на наличие ферментов каталазы, оксидазы, уреазы, бета-галактозидазы, образование индола, редукции нитратов (таблица 9), определяют чувствительность к антибиотикам.
Эти тесты позволяют подтвердить выделение гемофилов и дать ориентировочный ответ о выделении H. influenzae уже через 24 часа после получения материала для бактериологического исследования.
Третий день. Из культур, выросших на шоколадном агаре, готовят мазки и окрашивают по Граму и Гинсу. Культуру идентифицируют до вида по тестам (см. табл.9 и 10).