Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений (не действует на территории РФ на основании приказа Минздрава России от 24.08.2020 N 889)

1. Определение редукции нитратов

Принцип. Метод основан на способности микроорганизмов восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) до солей азотистой кислоты (нитриты) и далее до последующих продуктов восстановления (аммиак, молекулярный азот, окись азота, гидроксиламин). Редукция нитратов в нитриты определяется с помощью реактива Грисса, а газообразные продукты - с помощью поплавка.

Ингредиенты:

бактопептон;

калий азотнокислый (KNO);

сульфаниловая кислота;

альфа-нафтиламин;

уксусная кислота - 5 моль/л;

цинк металлический.

Приготовление нитратного бульона. Берут KNO - 1,0 г; бактопептона - 5,0 г; добавляют воды дистиллированной до 1000 мл, pH 7,4. Нитратный бульон разливают в химически чистые пробирки с поплавками по 5 мл. Автоклавируют при 0,5 атм. (115°C) в течение 20 минут.

Приготовление реактива Грисса. Раствор 1. 0,8 г сульфаниловой кислоты растворяют в 100 мл 5 моль/л уксусной кислоты при слабом нагревании.

Раствор 2. 0,6 г альфа-нафтиламина растворяют в 100 мл 5 моль/л уксусной кислоты при слабом нагревании.

Растворы хранят в посуде из темного стекла с притертыми пробками. Перед употреблением 1 и 2 растворы смешивают в равных объемах.

Ход исследования. Перед посевом в среду добавляют 20% инактивированной сыворотки. Посевы выдерживают в термостате при 37°C до 5-7 дней.

После инкубации в каждую пробирку с культурой вносят реактив Грисса по 0,1 мл.

Оценка результатов. Появление красного окрашивания через 30 секунд после добавления реактива Грисса свидетельствует о редукции нитратов до нитритов - реакция положительная. Отсутствие окрашивания свидетельствует о том, что реакция отрицательная или произошло восстановление до последующих продуктов. Поэтому при отсутствии окрашивания в пробирку добавляют на кончике скальпеля порошок металлического цинка и результат оценивают: окраска не проявляется - нитраты в среде отсутствуют, т.к. редуцированы бактериями до нитритов и далее - до последующих продуктов восстановления (реакция положительная); появляется красное окрашивание - нитраты в среде редуцированы до нитритов, но не бактериями, а цинком (реакция отрицательная).