ГОСТ 34896-2022 Методы испытаний по воздействию химической продукции на организм человека. Сенсибилизация кожи in vitro. Метод определения люциферазы ARE-Nrf2

     3 Методы

3.1 Обоснование и принципы методов испытаний, представленных в стандарте по проведению испытаний на основе ключевых событий

3.1.1 Оценивание сенсибилизации кожи обычно проводится с использованием лабораторных животных. Классические методы исследований с использованием подопытных морских свинок, максимизационная сенсибилизирующая проба на морских свинках (Guinea Pig Maximisation Test - GPMT) Магнуссона и Клигмана либо тест Бюлера [11] позволяют оценить как фазу индукции, так и контрольную фазу исследования сенсибилизации кожи. Методы исследований с использованием мышей, такие как LLNA [12] и три его модификации, для которых не требуется применение радиоактивных веществ - LLNA:DA [13], LLNA:BrdU-ELISA и BrdU-FCM [14], оценивают только идукционный ответ, и поэтому заслужили признание по сравнению с испытаниями на морских свинках с точки зрения меньшего нанесения вреда животным в сочетании с возможностью получения объективных данных измерений, иллюстрирующих течение фазы индукции для сенсибилизации кожи.

3.1.2 Новым способом оценивания потенциальных уровней опасности развития сенсибилизации кожи при воздействии химических веществ стало применение методов испытаний in chemico и in vitro, основанных на механистических моделях и воспроизводящих первые три ключевых события АОР для сенсибилизации кожи. В [15] описывается метод прямого анализа реакционной способности пептидов, что соответствует первому ключевому событию; в центре внимания настоящего стандарта находится процесс активации кератиноцитов [15], ассоциируемый со вторым ключевым событием, а [16] в свою очередь рассказывает об активации дендритных клеток, третьем ключевом событии АОР для сенсибилизации кожи. Четвертое ключевое событие, заключающееся в пролиферации Т-клеток, оценивается косвенным образом - по методу изучения реакции регионарных лимфатических узлов (Local Lymph Node Assay - LLNA), с использованием подопытных мышей [12].

3.1.3 Так как активация кератиноцитов представляет собой лишь одно из ключевых событий АОР, вызывающих сенсибилизацию кожи [2], [17], сведения, получаемые с помощью методов испытаний, разработанных специально для наблюдения за данным ключевым событием, могут оказаться недостаточными в случае их самостоятельного применения для подготовки заключения о наличии или отсутствии у этих веществ способности оказывать сенсибилизирующее воздействие на кожу. Поэтому данные, полученные с помощью методов, описанных в настоящем стандарте, предлагается рассматривать как существенные при решении вопросов об отнесении того или иного вещества к перечню веществ, способных вызывать сенсибилизацию кожи (т.е. к классу опасности 1 согласно СГС ООН), либо неаллергенных веществ в порядке реализации этих методов в рамках интегрированных подходов к испытаниям и оценке (Integrated Approaches to Testing and Assessment - IATA), наряду с прочей дополняющей ее значимой информацией, характеризующей иные ключевые события в структуре АОР для кожной сенсибилизации по результатам экспериментов in vitro, а также информацией, полученной с применением методов, не предусматривающих непосредственного проведения испытаний, таких как сопоставление по методу аналогий с веществами, обладающими схожими химическими свойствами [17]. Опубликованы примеры использования данных, полученных с применением этих методов, в рамках так называемых установленных подходов (Defined Approaches), т.е. подходов, стандартизированных как с точки зрения набора используемых источников информации, так и с точки зрения порядка формирования прогнозного заключения [17], которые также могут быть востребованы при выполнении работ в рамках IATA.

3.1.4 Методы испытаний, описанные в настоящем стандарте, не предназначены для автономного применения и не обеспечивают возможность классификации веществ, вызывающих сенсибилизацию кожи, в соответствии с подклассами опасности 1A и 1B, как предусмотрено СГС ООН [1], для нужд официальных органов, контролирующих эти две необязательные подклассу, а также не могут применяться для целей прогнозирования способности исследуемых веществ вызывать сенсибилизацию в процессе принятия решений по оценке необходимых мер безопасности при обращении с этими веществами. Тем не менее при условии, что это не противоречит требованиям действующего законодательства, положительные результаты, полученные с помощью этих методов, могут сами по себе рассматриваться как достаточное основание для отнесения химического вещества к классу опасности 1 согласно СГС ООН.

3.1.5 Под "исследуемой химической продукцией" для целей настоящего стандарта понимается продукция, которая подвергается испытаниям, использование данного термина не связано с возможностью применения предлагаемых методов для исследования тех или иных однокомпонентных веществ, многокомпонентных веществ и/или их смесей. При проведении испытаний на погруженных культурах важно убедиться в достаточном растворении исследуемой химической продукции в соответствующей рабочей среде или по меньшей мере в образовании ей устойчивой взвеси (например, путем проведения визуального контроля раствора вещества, приготовленного с использованием этой среды в максимальной предусмотренной конечной концентрации, с целью подтвердить отсутствие нерастворенных остатков, а также исключить вероятность выпадения осадка или разделения фаз в растворе, которому предварительно позволили отстояться в течение нескольких часов).

3.1.6 Количество доступной информации о возможности применения предлагаемых методов для анализа многокомпонентных веществ и смесей веществ в настоящее время ограничено [18], [19], [20]. Тем не менее, несмотря на отсутствие заключения по результатам соответствующего валидационного испытания, с технической точки зрения эти методы можно считать пригодными для испытания таких веществ и смесей. Перед исследованием смесей, химических веществ, определение которых затруднено (например, нестабильных), или таких химических веществ, которые не могут быть с уверенностью отнесены к области применения настоящего стандарта, в каждом случае следует уточнять, в какой мере результаты такого испытания могут быть научно обоснованными. Кроме того, в процессе проведения испытаний многокомпонентных веществ или смесей не следует забывать об опасности неверного толкования характера наблюдаемых реакций за счет воздействия присутствующих в этих веществах и смесях цитотоксических составляющих (так, например, последствия высокого уровня содержания цитотоксических составляющих, не обладающих сенсибилизирующими свойствами, могут маскировать отклик на присутствие слабо аллергенных составляющих либо выраженных аллергенных составляющих, представленных в низкой концентрации). Соответственно, в конкретной ситуации оправданным с научной точки зрения шагом следует считать организацию раздельных испытаний ключевых составляющих, преобладающих в данной смеси, т.е. одной основной либо нескольких более мелких фракций, результаты которых позволяли бы в дальнейшем достоверно судить о сенсибилизирующем потенциале смеси в целом.

3.2 Сенсибилизация кожи in vitro. Метод исследования KeratinoSens™ на основе сигнального пути ARE-Nrf2 с использованием люциферазы

3.2.1.Исходные положения, пригодность и ограничения

3.2.1.1 Метод исследования, изложенный в пункте 3.2, касается второго ключевого события АОР для сенсибилизации кожи [2], а именно активации кератиноцитов, путем использования люциферазы для получения оценки интенсивности опосредуемой через Nrf2 активации генов, зависимых от элемента антиоксидантного ответа (ARE). Известно, что воздействие веществ, вызывающих кожную сенсибилизацию, приводит к индукции генов, регулируемых с помощью ARE [22], [3]. Низкомолекулярные электрофильные вещества, к числу которых следует относить кожные аллергены, способны вызывать изменения в сенсорном белке Kеар1 (Kelch-подобном ЕСН-ассоциированном протеине 1), например за счет ковалентной модификации его цистеинового остатка, что влечет за собой его диссоциацию от транскрипционного фактора Nrf2 (ядерного фактора 2, связанного с эритроидным фактором 2). После диссоциации Nrf2 может активировать ARE-зависимые гены, такие как гены, кодирующие ферменты фазы детоксикации II [22], [23], [24].

3.2.1.2 Метод KeratinoSens™ для проведения испытаний in vitro на основе сигнального пути ARE-Nrf2 с использованием люциферазы (далее - KeratinoSens™) успешно прошел соответствующие исследования [3], [23], [5], необходимые для его валидации, с последующим вынесением независимой экспертной оценки Референтной лабораторией Европейского союза по валидации методов, альтернативных методам испытаний на животных (EURL ECVAM) [6]. Метод KeratinoSens™ признан научно обоснованным и допущен к применению в рамках IATA для идентификации между веществами, способными и не способными вызывать кожную сенсибилизацию, в целях определения степени их опасности [6].

3.2.1.3 В соответствии с данными, полученными в ходе проведения валидационных исследований, а также результатами специализированных внутрилабораторных испытаний, использованными на этапе независимой экспертной оценки, метод подтвердил свою пригодность для применения на базе лабораторий, которые уже имеют достаточный опыт выполнения аналитических работ с клеточными культурами [6]. Ожидаемый уровень воспроизводимости прогнозных заключений для метода исследования KeratinoSens™ составляет порядка 85% как при подготовке их в пределах одной лаборатории, так и при подготовке различными лабораториями [6]. При расчете показателей точности (77% - 155/201), чувствительности (78% - 71/91) и специфичности (76% - 84/110) метода KeratinoSens™ для идентификации веществ, способных вызывать кожную сенсибилизацию (т.е. относящихся к классу опасности 1 согласно СГС ООН) и не способных вызывать кожную сенсибилизацию, по сравнению с аналогичными результатами, обеспечиваемыми методом LLNA, были использованы все доступные данные, представленные в EURL ECVAM для оценки результативности и проведения экспертного анализа метода [6]. Полученные значения согласуются с опубликованными значениями, полученными по итогам проведения внутрилабораторных испытаний приблизительно 145 испытанных веществ (точность - 77%, чувствительность - 79%, специфичность - 72%) [5], что указывает на пригодность метода исследования KeratinoSens™ к применению в качестве вспомогательного средства для выявления опасностей, связанных с развитием кожной сенсибилизации. Впрочем, показатели точности, приведенные выше для метода KeratinoSens™, как если бы он выступал в роли самостоятельно применяемого метода исследования, выполняют здесь сугубо справочные функции, поскольку любые результаты, полученные с его помощью, следует рассматривать не автономно, а в сочетании с информацией из других источников - в контексте соответствующего установленного подхода или IATA и с учетом положений пунктов 3.1.3 и 3.1.4. В свою очередь, при подготовке оценки эффективности применения методов определения кожной сенсибилизации, не требующих использования подопытных животных, важно иметь в виду, что применение метода LLNA, равно как и других методов, которые предполагают проведение испытаний на животных, может не в полной мере раскрывать характер воздействия исследуемого вещества на организм человека.

3.2.1.4 Исходя из имеющихся данных, установлено, что метод KeratinoSens™ подходит для проведения исследований широкого спектра химической продукции, включающей различные органические функциональные группы, механизмы реакций, сенсибилизирующий потенциал при воздействии на кожу (подтвержденным путем проведения испытаний in vivo), а также различные физико-химические свойства [3], [4], [5], [6]. Метод испытаний применим к химической продукции, свободно растворимой в соответствующей рабочей среде или образующей в ней устойчивую взвесь (т.е. коллоидный раствор или суспензию, в которых химическая продукция не образует осадка и не разделяется на фазы). Если химическая продукция не удовлетворяет указанным условиям при максимальном требуемом конечном значении концентрации в размере 2000 мкМ, могут быть проведены ее исследования при более низких значениях концентрации. В подобных случаях результаты, удовлетворяющие необходимым критериям для отнесения их к положительным, все еще могут рассматриваться как доказательство способности исследуемой химической продукции вызывать кожную сенсибилизацию. Отрицательные результаты, полученные при проведении испытаний с максимальным достигаемым значением концентрации менее 1000 мкМ и при полном отсутствии цитотоксических проявлений, должны рассматриваться как "сомнительные" (см. модель построения прогнозов в 3.2.4.3.1). В то же время, если в процессе испытаний с максимально достигаемой концентрацией испытательного раствора менее 1000 мкМ можно наблюдать некоторые признаки цитотоксического воздействия (уровень жизнеспособности менее 70%), то в этом случае при оценивании результатов эксперимента к ним все еще могут применяться соответствующие критерии, позволяющие интерпретировать такие результаты как достоверно отрицательные. Большинство однокомпонентных веществ со значением показателя LogP более 7 могут быть нерастворимы в используемой рабочей среде, однако если практическая возможность растворения или получения устойчивой взвеси такого вещества была подтверждена и задокументирована, проведение испытаний в соответствии с рассматриваемым методом считается для них допустимым.

3.2.1.5 К получаемым отрицательным результатам в любом случае следует относиться с осторожностью, поскольку в условиях применения рассматриваемого метода вещества, проявляющие исключительную химическую активность по отношению к лизиновым остаткам, могут быть ошибочно определены как вещества, дающие отрицательный отклик, исходя из того, что ключевым механизмом активации сигнального пути Keap1-Nrf2-ARE, по всей видимости, является электрофильная реакция стрессоров с нуклеофильными тиолами (цистеиновыми сульфгидрильными группами) Keap 1. Устранить эту неопределенность можно используя информацию, получаемую путем дополнительного анализа реакционной способности исследуемых веществ в отношении пептидов, в частности путем проведения исследований с применением методов, позволяющих различать реакции с цистеином и лизином. Кроме того, из-за ограниченного метаболического потенциала используемой клеточной линии [26] и с учетом особенностей условий проведения эксперимента прогаптены (т.е. химические вещества, требующие ферментной активации, например, с участием ферментов Р450) и прегаптены (т.е. химическая продукция, активируемая в процессе автоокисления), в особенности те, скорость окисления которых невелика, также могут давать отрицательные результаты. С другой стороны, установлено, что применение комбинации методов исследований, покрывающей 1, 2 и 3 ключевые события АОР, позволяет с высокой долей уверенности определять большую часть прегаптенов (т.е. химической продукции, активируемой в процессе автоокисления) и прогаптенов (т.е. химической продукции, требующей ферментной активации, например, с участием ферментов Р450), таким образом, получаемые с помощью такого подхода отрицательные результаты, как правило, являются достаточно убедительными и могут использоваться для классификации химической продукции по степени ее опасности [28], [36], [34]. Также существует вероятность получения ложноположительных результатов для такой исследуемой химической продукции, которая не обладает сенсибилизирующими свойствами, но воздействие которой может выступать как фактор химического стресса [6]. Наконец, химическая продукция, способная взаимодействовать с ферментом люциферазой, может оказывать нежелательное влияние на ее активность при проведении экспериментов на клеточных культурах, заключающееся либо в отчетливом ингибировании реакций, либо, напротив, в усилении люминесценции [29]. Так, например, по опыту проведения иного рода исследований репортерных генов с использованием люциферазы известно, что фитоэстрогены в концентрации, превышающей 1 мкМ, влияют на распространение сигналов люминесценции, что объясняется сверхактивацией ее репортерного гена [30]. Как следствие, любые случаи экспрессии люциферазы, достигаемой при высоких значениях концентрации фитоэстрогенов или близких к ним соединений, которые, подобно фитоэстрогенам, могут вызывать сверхактивацию репортерного гена люциферазы, подлежат отдельному тщательному изучению [30]. При наличии доказательств, свидетельствующих о непригодности метода KeratinoSens™ для исследований каких-либо других определенных категорий химической продукции, его не следует применять с этими конкретными категориями химической продукции.