ГОСТ 34735-2021 Методы испытаний по воздействию химической продукции на организм человека. Методы испытаний с применением реконструированного рогового эпителия человека (RhCE) для определения химической продукции, не требующей классификации опасности как вызывающей раздражение или серьезное повреждение глаз (с Поправкой)

     7 Составляющие методов испытаний с использованием RhCE

7.1 Общие параметры моделей

Для получения трехмерной ткани, подобной эпителию роговицы, должен использоваться соответствующий клеточный материал человека, состоящий из уже начавших дифференцироваться, но еще не ороговевших клеток. Модель тканей RhCE выращивается во вставках с пористой синтетической мембраной, через которую в клетки попадают питательные вещества. Готовый реконструированный эпителий роговицы должен состоять из нескольких слоев жизнеспособных некератинизированных клеток. Поверхность эпителиальной ткани RhCE должна находиться на воздухе, чтобы непосредственное воздействие на нее исследуемой химической продукции при местном нанесении происходило в тех же условиях, что и при их попадании на эпителий роговицы in vivo. Модель ткани RhCE должна обладать сформированным функциональным барьером, достаточно устойчивым, чтобы противостоять быстрому проникновению эталонных цитотоксических веществ, таких как тритон X-100 или натрия додецилсульфат (НДС). Барьерные функции должны быть подтверждены, их оценка может проводиться либо путем определения времени, необходимого для снижения жизнеспособности ткани на 50% () после нанесения эталонного вещества с известной заданной концентрацией (например, от 50 до 100 мкл 0,3%-ного (по объему) раствора тритона X-100), либо путем определения концентрации, при которой эталонное вещество снижает жизнеспособность ткани на 50% () по истечении заданного периода воздействия (например, после 30 мин обработки 50 мкл НДС или 60 мин обработки 25 мкл НДС) (см. 7.2.5). Сдерживающие свойства модели RhCE должны препятствовать проникновению исследуемой химической продукции за края жизнеспособных тканей, так как это может снизить достоверность моделирования его воздействия на роговицу глаза. Клеточный материал человека, используемый для создания модели ткани RhCE, не должен быть контаминирован бактериями, вирусами, микоплазмой или грибами. Модели ткани должны контролироваться поставщиком на отсутствие грибов и бактерий.

7.2 Функциональные параметры модели

7.2.1 Жизнеспособность

Для оценки жизнеспособности ткани используют подходящий тетразолиевый краситель (ТК) (а именно: MTT для VRM1 и VRM2, WST-8 для LabCyte CORNEA-MODEL24 EIT или WST-1 для MCTT HCE EIT) [19], [21]. Жизнеспособные клетки модели ткани RhCE восстанавливают витальный краситель МТТ до синеокрашенного MTT-формазан преципитата, который затем экстрагируют из этой ткани при помощи изопропанола (или иного аналогичного растворителя). Альтернативно жизнеспособные клетки ткани RhCE восстанавливают витальный краситель WST-8 или WST-1, превращая его в водорастворимый желтый формазан. Количество экстрагированного формазанового красителя (ФК) может определяться путем измерений поглощения (ОП) или посредством ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии [48]. Значение ОП холостого раствора (им может быть растворитель-экстрагент для MTT, разбавленная среда WST-8 для испытаний с использованием WST-8 или разбавленная среда WST-1 для испытаний с использованием WST-1) должно быть достаточно низким, т.е. ОП<0,1. Пользователи модели ткани RhCE должны следить за тем, чтобы каждая используемая партия материала удовлетворяла действующим критериям отрицательной контрольной пробы. Диапазоны приемлемости значений ОП отрицательной контрольной пробы для методов VRM1, VRM2, LabCyte CORNEA-MODEL24 и MCTT HCE приведены в таблице 2. При использовании метода ВЭЖХ/УВЭЖХ-спектрофотометрии диапазоны значений ОП отрицательной контрольной пробы, приведенные в таблице 2, следует рассматривать как критерии соответствия отрицательных контрольных проб. В отчете об испытаниях должно быть задокументировано, что ткани, обработанные отрицательной контрольной пробой, являются неизменяемыми при культивировании (обеспечивают одинаковые показатели жизнеспособности) на протяжении заданного периода воздействия при проведении испытаний. Аналогичный порядок должен соблюдаться разработчиком/поставщиком ткани как часть действий по контролю качества партии материала, хотя применяемые критерии при этом могут отличаться от установленных в таблице 2. Диапазон приемлемости (верхний и нижний пределы) значений ОП отрицательной контрольной пробы (при контроле качества) должен соответствовать указанному разработчиком/поставщиком модели ткани RhCE.

Таблица 2 - Диапазоны приемлемости значений ОП отрицательных контрольных проб (для пользователей метода испытаний)

7.2.2 Барьерные функции

Модель ткани RhCE должна иметь достаточную толщину и прочность, для того чтобы препятствовать быстрому проникновению эталонных цитотоксических веществ, по оценке, например, (тритон X-100) или (НДС) (см. таблицу 3). Барьерные функции каждой партии модели ткани RhCE должны быть подтверждены разработчиком/поставщиком соответствующей модели ткани после доставки тканей конечному пользователю (см. 7.2.5).

7.2.3 Морфология

При гистологическом исследовании любой модели ткани RhCE должно подтверждаться наличие в ней структуры, аналогичной структуре эпителия роговицы человеческого глаза (в том числе не менее трех слоев жизнеспособных эпителиальных клеток и некератинизированного эпителия). Для трех методов испытаний наличие у моделей тканей соответствующей морфологии подтверждается непосредственно разработчиком/поставщиком, следовательно, у пользователя, применяющего эти методы, отсутствует необходимость в самостоятельном подтверждении ее соответствия для каждой новой партии.

7.2.4 Воспроизводимость

Результаты испытаний положительных и отрицательных контрольных проб, полученные с применением соответствующего метода, должны обладать долговременной воспроизводимостью.