ГОСТ 34735-2021 Методы испытаний по воздействию химической продукции на организм человека. Методы испытаний с применением реконструированного рогового эпителия человека (RhCE) для определения химической продукции, не требующей классификации опасности как вызывающей раздражение или серьезное повреждение глаз

     4 Сущность метода испытаний

4.1 Исследуемую химическую продукцию наносят на поверхность не менее чем двух образцов трехмерной модели ткани RhCE и определяют жизнеспособность тканей непосредственно после воздействия и по истечении следующего за обработкой периода инкубирования. Для получения тканей RhCE используют первичные эпидермальные кератиноциты человека, иммортализованные эпителиальные клетки роговицы человека либо первичные эпителиальные клетки роговицы человека, которые культивируют в течение нескольких дней до формирования из них высокодифференцированного многослойного плоского эпителия, сходного по строению с эпителием роговицы человеческого глаза. Модели тканей RhCE для методов EpiOcular, LabCyte CORNEA-MODEL24 и MCTT HCE должны состоять не менее чем из трех слоев жизнеспособных клеток и иметь некератинизированную поверхность, формируя таким образом структуру, подобную роговице в методе in vivo [27]. Модель ткани RhCE для метода SkinEthic HCE предполагает наличие не менее четырех слоев жизнеспособных клеток, включающих в себя цилиндрические базальные клетки, шиповатые промежуточные клетки и чешуйчатые поверхностные клетки, аналогично обычному роговичному эпителию человека [26], [35].

4.2 Химически вызванное серьезное повреждение/раздражение глаз, основными признаками которого in vivo обычно являются помутнение роговицы, воспаление радужной оболочки, покраснение и/или отек конъюнктивы, представляет собой результат цепочки событий, начинающейся с проникновения химической продукции через роговицу и/или конъюнктиву и заканчивающейся разрушением клеток. В повреждении клеток могут быть задействованы различные механизмы, в том числе: лизис клеточной мембраны (например, поверхностно-активными веществами, органическими растворителями); коагуляция макромолекул, в частности белков (например, поверхностно-активными веществами, органическими растворителями, щелочами и кислотами); омыление жиров (например, щелочами); а также алкилирование или иного рода ковалентное взаимодействие с макромолекулами (например, при участии отбеливающих средств, пероксидов и алкиляторов) [19], [36], [37]. В то же время доказано, что именно цитотоксический аспект имеет чрезвычайно большое, если не решающее значение для определения общей способности химической продукции вызывать серьезное повреждение/раздражение глаз, вне зависимости от того, какими конкретно физико-химическими процессами была спровоцирована подобная реакция [38], [39]. Более того, потенциальная способность вызывать серьезное повреждение/раздражение глаз в целом определяется размером первичных повреждений [36], коррелирующих с количеством погибших клеток [38], а также с масштабом дальнейших реакций и вероятных последствий воздействия [40], [41]. Таким образом, если химическая продукция, способная вызывать самое легкое раздражение, как правило, воздействует лишь на поверхностный слой эпителия роговицы, то от химической продукции со слабой и средней раздражающей способностью страдают главным образом эпителий и поверхность стромы, а химическая продукция с сильной раздражающей способностью разрушает эпителий, глубоко строму и в отдельных случаях эндотелий роговицы [39], [42]. В основе определения жизнеспособности ткани модели RhCE после воздействия нанесенной на ее поверхность химической продукции с целью идентификации химической продукции, которая не требует классификации как вызывающая серьезное повреждение/раздражение глаз (класс опасности согласно СГС ООН отсутствует), лежит предположение, что всякая химическая продукция, при воздействии которой развивается серьезное повреждение или раздражение глаз, вызывает цитотоксические реакции в эпителии роговицы и/или в конъюнктиве.

4.3 Традиционно жизнеспособность ткани RhCE может быть определена благодаря осуществляемому жизнеспособными клетками этой ткани процессу ферментного преобразования ТК (MTT для VRM1 и VRM2, WST-8 для LabCyte CORNEA-MODEL24 EIT или WST-1 для MCTT HCE EIT) в ФК (синеокрашенный MTT-формазан либо желтоокрашенный WST-8/WST-1-формазан). Для количественного определения синеокрашенного MTT ФК его вначале необходимо экстрагировать из тканей [20], тогда как желтоокрашенные WST-8 ФК или WST-1 ФК не нуждаются в дополнительном экстрагировании, поскольку являются водорастворимыми и для определения их количества непосредственно используется раствор красителя, в котором происходило инкубирование тканей при проведении испытания с использованием WST-8 [21] или WST-1 [22] соответственно. К химической продукции, не требующей классификации и маркировки согласно СГС ООН (класс опасности отсутствует), относят такую химическую продукцию, при воздействии которой жизнеспособность тканей не опускается ниже установленного предела (т.е. показатель жизнеспособности должен составлять >60% для методов EpiOcularEIT и SkinEthic HCE EITL; >50% для метода SkinEthic HCE EITS; >40% для метода LabCyte CORNEA-MODEL24 EIT либо >35% для жидкостей и >60% для твердой продукции при применении метода MCTT HCE EIT) (см. 7.2.9.1).