ГОСТ 34597-2019 Анодные заземления установок электрохимической защиты от коррозии подземных металлических сооружений. Методы определения биокоррозионной агрессивности грунтов и их влияния на подземные металлические сооружения

     9 Экспресс-метод определения коррозионноопасных бактерий в грунтах

9.1 Сущность метода

Метод основан на определении в пробах грунтов, прилегающих к подземным сооружениям, ДНК сульфатредуцирующих бактерий путем амплификации специфического фрагмента ДНК данных микроорганизмов методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. В качестве положительного контроля ПЦР берется ДНК бактерий - ДБГ.

Выявление ДНК сульфатредуцирующих бактерий методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией включает в себя три этапа:

- выделение ДНК из проб грунта;

- амплификация специфического фрагмента ДНК данных микроорганизмов (гена -субъединицы диссимиляционной сульфитредуктазы (dsrA));

- гибридизационно-флуоресцентная детекция продуктов амплификации, которая производится непосредственно в ходе ПЦР.

Второй и третий этапы производятся в микрочипе при помощи микрочипового амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме "реального времени". Микрочип для выявления ДНК сульфатредуцирующих бактерий представляет собой пластину, выполненную из кремния или алюминия, с присоединенной пластиковой подложкой (рисунок Г.1, приложение Г). В пластине расположены микрореакторы, внутри которых находится иммобилизованная тест-система для проведения реакции ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. Микрочип покрыт защитной пленкой.

9.2 Отбор, транспортировка и хранение проб - в соответствии с разделом 6 и с учетом нижеследующих требований.

Хранение проб в лаборатории осуществляется при температуре минус 70°С в течение 1 года. Допускается хранение проб грунта при температуре минус 20°С не более месяца или при температуре от 2°С до 8°С не более суток.

Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.

9.3 Средства измерений, химические реактивы и материалы - в соответствии с разделом 4 и приведенным в настоящем разделе:

- микроцентрифуга настольная для пробирок конических полипропиленовых с крышкой объемом 1,5-2 см с максимальным ускорением не менее 11000 g;

- аппарат для встряхивания типа "Вортекс" или микроцентрифуга - типа "Вортекс" (максимальное ускорение 450 g) с адаптером для горизонтального встряхивания;

- ламинарный бокс или бокс для ПЦР со встроенной системой УФ-облучения по нормативно-технической документации, действующей на территории страны, принявшей стандарт;

- микрочиповый амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени, работающий по каналам FAM (возбуждение в диапазоне от 480 до 500 нм, регистрация в диапазоне от 510 до 540 нм) и ROX (возбуждение в диапазоне от 560 до 590 нм, регистрация в диапазоне от 610 до 660 нм) с пределами обнаружения по каждому из каналов не выше 0,01 пмоль/мкл, например, "АриаДНА";

________________

Эта информация приведена исключительно для удобства пользователя настоящего стандарта и не является поддержкой указанного продукта. Могут быть использованы иные устройства, обеспечивающие проведение исследований в соответствии с установленными в настоящем стандарте требованиями.

- микрочипы для выявления ДНК сульфатредуцирующих бактерий в комплекте с буферным раствором и герметизирующей жидкостью;

- наборы для выделения ДНК из образцов почв, например, "DNeasy PowerSoil Kit" производства "QIAGEN", США.

________________

Эта информация приведена исключительно для удобства пользователя настоящего стандарта и не является поддержкой указанного продукта. Могут быть использованы иные наборы, обеспечивающие проведение исследований в соответствии с установленными в настоящем стандарте требованиями.

- пробирки микроцентрифужные конические полипропиленовые с крышкой типа Эппендорф вместимостью 0,6; 1,5 и 2 см.

- наконечники одноразовые с фильтром к механическим и электронным дозаторам.

9.4 Требования к организации работ

Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности, осуществляется в соответствии с требованиями [5], [6].

9.5 Выделение ДНК из проб грунта

Выделение ДНК проб грунта проводят в соответствии с инструкцией к используемому набору.

Срок хранения образцов ДНК, выделенной из проб грунта, - 1 год при температуре минус 20°С.