ГОСТ ISO/TR 10993-33-2018 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 33. Руководство по испытаниям на генотоксичность. Дополнение к ISO 10993-3 (Переиздание)

     7.3.2 Исследуемые концентрации

Учитываемыми критериями при определении максимальной концентрации являются цитотоксичность, растворимость в системе исследования и изменения в pH или осмолярность.

Рекомендуемая максимальная исследуемая концентрация будет зависеть от избранного метода приготовления тестируемого образца. Согласно ISO 10993-12 достаточно использования 100%-ного экстракта тестируемого образца, и исследование других доз не является необходимым. В соответствии с приложением A ISO 10993-3 необходимо учитывать следующее:

a) для растворимых нецитотоксичных тестируемых образцов (см. приложение А, метод А, ISO 10993-3) рекомендуемая максимальная исследуемая концентрация составляет 5 мг/мл или 5 мкл/мл. Для нецитотоксичных тестируемых образцов, которые не растворимы при концентрации 5 мг/мл или 5 мкл/мл, одна или более из исследуемых концентраций должны быть нерастворимыми в окончательном образце. Тестируемые образцы, уже являющиеся цитотоксичными в дозах менее 5 мг/мл или 5 мкл/мл, должны быть исследованы в концентрациях менее цитотоксичной. Преципитат не должен мешать подсчету;

b) для тестируемых образцов в соответствии с приложением А, метод В, ISO 10993-3 рекомендуемая максимальная исследуемая концентрация составляет 5 мг/мл, если это выполнимо. Для нецитотоксичных исследуемых образцов, которые не растворимы в концентрации 5 мг/мл, одна или более из исследуемых концентраций должны быть нерастворимыми в окончательном образце. Исследуемые образцы, уже являющиеся цитотоксичными в концентрации менее 5 мг/мл, должны быть исследованы в концентрациях менее цитотоксичной. Преципитат не должен мешать подсчету;

c) для тестируемых образцов в соответствии с приложением А, метод С, ISO 10993-3 рекомендуемой максимальной исследуемой концентрацией является 100%-ный экстракт образца. Для нецитотоксичных тестируемых образцов, которые не растворимы при 100%, одна или более из исследуемых концентраций должны быть нерастворимыми в окончательном образце. Исследуемые образцы, уже являющиеся цитотоксичными в концентрациях менее чем 100%, должны быть исследованы в концентрациях менее цитотоксичной.

Предпочтительна замена среды на свежую среду с экстрактом во избежание истощения питательных веществ.

Цитотоксичность следует определять в основном эксперименте как в присутствии метаболической активации, так и без нее, используя достоверные признаки целостности и роста клеток, такие как относительное повышение количества клеток (RICC) или относительное удвоение популяции (RPD), степень конфлюентности, количество жизнеспособных клеток или митотический индекс. Может быть полезным определение цитотоксичности и растворимости в предварительном эксперименте. При наличии цитотоксичности необходимо использовать по меньшей мере три анализируемые концентрации. Эти концентрации должны покрывать диапазон от максимальной до небольшой цитотоксичности или до ее отсутствия. Это означает, что интервал концентраций должен быть в промежутке между 2 и корнем квадратным из 10. На момент фиксации при максимальной концентрации должно быть значительное снижение удвоения популяции, количества клеток или митотического индекса (более чем на 50% по отношению к отрицательному контролю/растворителю). Митотический индекс является только косвенным измерением цитотоксичных/цитостатических эффектов и зависит от времени после введения вещества в культуру. Однако митотический индекс приемлем для суспензионных культур, в которых другие измерения цитотоксичности могут быть затруднены и трудно определимы. Для относительно нецитотоксичных экстрактов чистые экстракты должны быть исследованы в концентрации 10% (водные растворы) или 1,0% (безводные/растворители) от объема культуры. Если культуральная среда используется в качестве среды экстракции, рекомендуемая максимальная исследуемая концентрация составляет 100% экстракта тестируемого образца. Если культуральную среду без сыворотки используют в качестве полярного растворителя для экстракции, исследуемый экстракт исследуют в чистом виде после дополнения сывороткой перед введением клеток. Исследуемый экстракт в клеточной культуральной среде с сывороткой (как неполярный растворитель) исследуют как чистый экстракт. Тестируемые образцы, уже являющиеся цитотоксичными в концентрациях менее 100%, должны быть исследованы в концентрации, индуцирующей цитотоксичность, требуемую для исследования.

Для относительно нецитотоксичных тестируемых образцов максимальная концентрация должна составлять 5 мкл/мл (в случае чистых жидких химических веществ), 5 мг/мл или 0,01 М в зависимости от того, что соответствует самой низкой концентрации. В таких случаях приемлема единственная максимальная концентрация.