ГОСТ Р 57989-2017 Продукция пищевая специализированная. Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции

Введение

Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции являются альтернативными бактериологическому посеву и предусматривают ускоренное определение наличия или отсутствия ДНК и, соответственно, бактерий родов Salmonella, Shigella, Cronobacter (Enterobacter sakazakii), энтерогеморрагических Escherichia coli, термофильных Campylobacter spp. видов C. jejuni, C. coli, C. lari, Listeria monocytogenes в определенной массе (объеме) пищевого продукта, подвергнутого инкубации в жидких селективных питательных средах. Предварительная инкубация продуктов в питательных средах является обязательным этапом анализа, обеспечивающим биологическое накопление возбудителей.

При наличии эпидемиологических данных о возможности массивного заражения пищевого продукта искомыми возбудителями входе расследования вспышек пищевых отравлений и инфекций допускается анализировать инкриминированные пробы нативных (не подвергавшихся инкубации в жидких средах обогащения) пищевых продуктов с целью получения предварительных данных о причинном агенте вспышки. При этом положительные результаты ПЦР-анализа таких проб должны подтверждаться выделением возбудителя в культуре, а отрицательные результаты не должны интерпретироваться и не могут служить основанием для прекращения анализа проб с инкубацией.

Обнаружение патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией основано на выявлении последовательностей (фрагментов) ДНК, специфичных для геномов бактерий родов Salmonella, Shigella, Cronobacter, Campylobacter, энтерогеморрагических Escherichia coli, Listeria monocytogenes. В основе метода лежит амплификация нуклеотидных фрагментов-мишеней ДНК, ферментом Taq-полимеразой в присутствии синтетических олигонуклеотидных праймеров и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Гибридизация флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов, присутствующих в составе реакционной смеси, с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени сопровождается нарастанием флуоресценции. Измерение интенсивности флуоресцентного сигнала позволяет регистрировать накопление продуктов амплификации.

Методы предусматривают высев определенных количеств исследуемых проб пищевых продуктов в соответствующие неселективные и селективные питательные среды, инкубирование посевов для накопления микроорганизмов, экстракцию ДНК из культуральной жидкости, амплификацию участка ДНК целевых бактерий со специфичными праймерами и гибридизационно-флуоресцентную детекцию ампликонов, осуществляемую в одном из двух вариантов: в режиме реального времени в ходе ПЦР либо после завершения амплификации.

При положительных результатах обнаружения патогена жизнеспособность присутствующих в продукте искомых микроорганизмов подтверждают бактериологическим посевом с соответствующим биохимическим и серологическим типированием или ПЦР-анализом парных проб (прошедшей и не прошедшей культуральное обогащение) в режиме реального времени.

Методы выявления патогенных микроорганизмов на основе полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией могут использоваться для тестирования бактериальных культур микроорганизмов, выделенных из пищевых продуктов бактериологическими методами, с целью подтверждения их принадлежности к родам Salmonella, Shigella, Cronobacter, Campylobacter (видов С. ejuni, С. coli, С. lari), Listeria (вида L. monocytogenes), энтерогеморрагическим Е. coli в качестве дополнительных к биохимическим и серологическим методам идентификации.