ГОСТ 23454-2016 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ (с Поправками)

     7 Метод определения ингибирующих веществ с использованием тест-культуры термофильного стрептококка и индикатора резазурина

7.1 Сущность метода

Метод основан на диагностике развития в молоке чувствительной тест-культуры Streptococcus thermophilus В19 и восстановлении резазурина окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами.

По изменению или неизменению окраски резазурина визуально оценивают отсутствие/наличие ингибирующих веществ в молоке:

- при отсутствии в молоке ингибирующих веществ тест-культура Streptococcus thermophilus В19 развивается и окраска резазурина меняется с серо-сиреневой на сиреневую с розовым оттенком или розовую, вплоть до белой;

- при наличии в молоке ингибирующих веществ тест-культура Streptococcus thermophilus В19 не развивается либо ее развитие задерживается, а окраска резазурина остается серо-сиреневой или сиреневой.

Чувствительность метода позволяет обнаружить в молоке массовую концентрацию пенициллина - 0,004 мг/дм, стрептомицина - 10 мг/дм, тетрациклина - 1 мг/дм, левомицетина - 5,0 мг/дм; массовую долю активного хлора - 0,06%, перекиси водорода - 0,005%, надуксусной кислоты - 0,005%, сульфонола - 0,15%, формалина - 0,004%.

7.2 Подготовка к анализу

7.2.1 Приготовление стерильного обезжиренного молока

Обезжиренное молоко разливают по 100 см в колбы вместимостью не менее 200 см или по 10 см в пробирки вместимостью не менее 20 см и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение (10±1) мин.

7.2.2 Приготовление основного раствора резазурина натриевой соли

Основной раствор резазурина натриевой соли массовой концентрации 0,0005 г/см готовят следующим образом.

0,100 г резазурина натриевой соли переносят в мерную колбу вместимостью 200 см и растворяют в небольшом количестве прокипяченной и охлажденной до температуры (25±2)°С дистиллированной воды. Объем раствора доводят до метки прокипяченной и охлажденной до температуры (25±2)°С дистиллированной водой. Смесь тщательно перемешивают.

Раствор резазурина натриевой соли хранят при температуре от 4°С до 10°С не более 30 сут.

7.2.3 Приготовление коллекционной тест-культуры

7.2.3.1 Для восстановления активности тест-культуры колбу со 100 см обезжиренного стерилизованного молока, подготовленного по 7.2.1, подогревают до температуры (43±1)°С. Порцию сухой бактериальной закваски тест-культуры Streptococcus thermophilus В19 вносят в стерилизованное молоко и тщательно перемешивают.

Культуру термостатируют при температуре (41±1)°С в течение 16-18 ч до образования плотного сгустка, затем охлаждают до температуры (4±2)°С и используют для приготовления коллекционной тест-культуры.

7.2.3.2 Для приготовления коллекционной тест-культуры в пробирку с 10 см стерильного обезжиренного молока вносят одну петлю культуры, приготовленной по 7.2.3.1, и выдерживают в термостате при температуре (41±1)°С в течение 16-18 ч.

Коллекционную культуру хранят при температуре (4±2)°С и пересевают через 10-14 сут. Через 3-4 пересадки ее снова готовят из сухой тест-культуры.

Допускается использовать культуру дольше, если она не утратила своей активности и по микроскопическому препарату соответствует предъявленным требованиям: продолжительность сквашивания при пересеве - не более 16-18 ч; сгусток плотный; консистенция однородная, допускается мягкая крупитчатость или вязкая; в поле зрения микроскопа в препарате тест-культуры - диплококки одиночные или собранные в цепочки.

7.2.4 Приготовление рабочей тест-культуры

7.2.4.1 Рабочую тест-культуру готовят из коллекционной тест-культуры в пробирках или колбах в зависимости от необходимого количества или из сухой бактериальной закваски термофильного молочнокислого стрептококка, предназначенной для определения ингибирующих веществ.

7.2.4.2 При приготовлении рабочей тест-культуры из коллекционной в пробирку с 10 см стерильного обезжиренного молока вносят одну петлю коллекционной тест-культуры, а в колбу со 100 см стерильного обезжиренного молока вносят 0,1 см коллекционной тест-культуры или сухой бактериальной закваски на кончике ланцета и выдерживают в термостате при температуре (41±1)°С 16-18 ч до образования плотного сгустка.

Полученную рабочую тест-культуру используют для проведения анализа.

В случае необходимости рабочую тест-культуру хранят в холодильнике температурой (4±2)°С и используют в течение 24 ч.

Непосредственно перед применением рабочую тест-культуру перемешивают путем интенсивного встряхивания.

7.2.5 Приготовление контрольного раствора препарата СКИВ

Для получения контрольного раствора препарата вскрывают флакон с сухим препаратом СКИВ. Во флакон вносят пипеткой 10 см дистиллированной воды, подогретой до температуры (50±10)°С, закрывают пробкой и встряхивают до полного растворения.

Контрольный раствор препарата СКИВ готовят непосредственно перед испытанием, после проведения испытаний раствор хранению не подлежит.