8 Методы анализа
8.1 Метод определения количества S. aureus с предварительным обогащением
8.1.1 Сущность метода
Метод основан на высеве навески продукта и (или) его разведения в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, учете положительных пробирок (колб), пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и (или) атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам и S. aureus.
8.1.2 Проведение анализа
8.1.2.1 Выбор разведений для посева
Из навески продукта готовят ряд десятикратных разведений так, чтобы можно было определить наличие или отсутствие S. aureus в определенной массе (объеме), указанной в нормативном или техническом документе на конкретный продукт.
8.1.2.2 Посев
Навеску продукта или его разведения засевают по 1 см в пробирки или колбочки с солевым бульоном (6.2.3). Соотношение между количеством высеваемого продукта или его эквивалентным разведением и питательной средой 1:10.
Пробирки и колбочки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37±1)°С в течение (24-48) ч. Предположительное присутствие коагулазоположительных стафилококков определяется по помутнению среды.
Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на солевом бульоне к коагулазоположительным стафилококкам, для получения изолированных колоний делают пересев петлей из бульона на чашки Петри с подсушенными средами типа Байрд-Паркер (6.2.5), желточно-солевого агара (6.2.2) или молочно-солевого агара (6.2.4) по прошествии 24 ч инкубирования из предположительно положительных пробирок; все оставшиеся пробирки - после 48 ч.
Чашки с посевами выдерживают в термостате при температуре (37±1)°С в течение (24-48) ч. После термостатирования посевы просматривают и отмечают рост характерных колоний.
На желточно-солевом агаре колонии коагулазоположительных стафилококков имеют форму плоских дисков диаметром (2-4) мм белого, желтого, кремового, лимонного, золотистого цвета с ровными краями; вокруг колоний образуется радужное кольцо и зона помутнения среды.
На молочно-солевом агаре колонии коагулазоположительных стафилококков растут в виде непрозрачных круглых колоний, окрашенных от белого до оранжевого цвета, диаметром (2-4) мм, слегка выпуклых.
На среде Байрд-Паркера колонии коагулазоположительных стафилококков растут в виде черных, блестящих, выпуклых колоний диаметром (1-1,5) мм, окруженных зоной просветления среды шириной (1-3) мм.
8.1.3 Подтверждение принадлежности типичных и атипичных колоний
Для подтверждения принадлежности типичных и атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам отбирают не менее пяти типичных и/или атипичных колоний с каждой чашки Петри. Для подтверждения принадлежности отобранных типичных и атипичных колоний к коагулазоположительным стафилококкам пересевают каждую отобранную колонию отдельно на поверхность скошенного питательного агара по 6.2.6.
Посевы инкубируют при температуре (37±1)°С в течение (24±3) ч.
Для подтверждения принадлежности к коагулазоположительным стафилококкам у выросших и отобранных микроорганизмов определяют отношение к окраске по Граму - по ГОСТ 32901; способность образовывать каталазу и способность коагулировать плазму крови кролика.
8.1.3.1 Коагулазоположительные стафилококки окрашиваются по Граму положительно (в темно-фиолетовый цвет), имеют шарообразную форму и располагаются чаще (но не всегда) в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда.
8.1.3.2 Определение способности микроорганизмов образовывать каталазу
На колонию микроорганизмов, взятую с поверхности питательной среды или извлеченную из нее, помещенную на предметное стекло и выдержанную на воздухе в течение 30 мин, пипеткой наносят каплю 3%-ного раствора перекиси водорода (6.2.14). Если через (30-60) с на стекле появляются пузырьки газа, то считают, что они образовались в результате разложения перекиси водорода каталазой, образуемой микроорганизмами.
Коагулазоположительные стафилококки образуют каталазу.
8.1.3.3 Определение способности коагулировать плазму крови кролика
Способность коагулировать плазму крови кролика определяют у микроорганизмов, окрашивающихся положительно и образующих каталазу.
В пробирку с 0,5 см разведенной кроличьей плазмы (6.2.9) вносят петлю суточной агаровой культуры и тщательно перемешивают. Одну пробирку с плазмой оставляют незасеянной, а в другую засевают контрольный штамм S. aureus (коагулазоположительный стафилококк). Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температуре (37±1)°С в течение (3-6) ч. Если по истечении 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то пробирки оставляют в термостате до 24 ч. Если через 24 ч плазма не свернулась, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной.
При определении коагулазной активности реакцию считают отрицательной, если в плазме не образуются отдельные нити или сгустки или если в плазме появились отдельные нити (реакцию плазмокоагуляции оценивают на один плюс).
При определении коагулазной активности реакцию считают положительной, если: