ГОСТ Р 57166-2016 Вода. Определение токсичности по выживаемости пресноводных инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg (Переиздание)

Приложение В
(обязательное)

Культивирование и подготовка к тестированию тест-организмов

В.1 Условия культивирования тест-организмов. Общие требования

В.1.1 Исходный материал для культивирования тест-организмов Paramecium caudatum Ehrenberg получают в лабораториях, занимающихся тестированием, имеющих культуру требуемой видовой принадлежности (или из коллекций). Чувствительность культуры к модельному токсиканту двухромовокислому калию (5.3.2.4) должна соответствовать установленному в настоящем стандарте диапазону за 24 ч.

Примечание - Тест-организмы - пресноводные инфузории Paramecium caudatum Ehrenberg допускается выделять из природных водоемов. Выделение культуры проводят следующим способом: банкой вместимостью 1 дм у самого берега зачерпывают воду с илом и как можно быстрее под микроскопом (увеличение в 100 раз) просматривают пробы. Обнаруженных Paramecium caudatum Ehrenberg последовательно переносят в микроаквариумы объемом сначала со смесью среды пробы и культуры в соотношении 2:1, затем увеличивают содержание культуральной жидкости в микроаквариумах через каждый час и помещают в чистый минеральный раствор.

Для определения инфузорий используют "Определитель пресноводных беспозвоночных…" (Мажейкайсте, 1977) [6].

Тест-организмы культивируют на минеральной среде Лозина-Лозинского и содержат в климатостате, инкубаторе или в помещении с регулируемой температурой (25±2)°С.

При этом обеспечивают естественное или искусственное освещение так, чтобы соблюдались следующие периоды: 16 ч - воздействие света при освещенности 500-1000 лк, 8 ч - без воздействия света (в темноте).

Тест-организмы Paramecium caudatum Ehrenberg необходимо защищать от воздействия прямого солнечного света.

Тест-организмы и минеральная среда, в которой проводят их культивирование, должны содержаться в емкостях только из стекла.

Емкости, применяемые для культивирования тест-организмов, должны быть оснащены свободными или перфорированными крышками, чтобы уменьшить испарение, но обеспечить газообмен.

Емкости тщательно моют при каждой замене минеральной среды.

В качестве корма используют сухие пекарские дрожжи. Сухие пекарские дрожжи, предназначенные для кормления тест-организмов, хранят при комнатной температуре от 20°С до 25°С не более одного года.

Примечания

1 Тест-организмы - пресноводные инфузории Paramecium caudatum Ehrenberg имеют широкое географическое распространение, обладают коротким жизненным циклом и требуют минимум пространства и оборудования для культивирования и проведения тестирования. Тест-организмы могут культивироваться постоянно в лабораторных условиях.

2 Короткий жизненный цикл, быстрота размножения позволяют проследить реакцию на интоксикацию в относительно короткий срок в длинном ряду поколений. Используя принцип клонирования, можно получить большое количество генетически однородного материала.

3 Размножение инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg происходит путем продольного деления взрослого организма пополам в течение 1 суток. Темп деления инфузорий 1-2 шт. в сутки.

Для экспериментов используют клональные культуры инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg.

Клон выводят следующим способом: одну особь освобождают от посторонней микрофлоры путем последовательной пересадки через несколько микроаквариумов с минеральной средой и оставляют для размножения. Когда количество разделившихся инфузорий становится достаточным (30-40 шт.), их пересаживают в емкость со средой Лозина-Лозинского.

Полученную таким способом культуру инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg адаптируют к заданной температуре в течение 3-4 недель при температуре 24°С-25°С - в термостате, при 12°С-13°С и 4°С-5°С - в холодильниках.

Колебания температуры не должны превышать ±1°С.

Для поддержания стандартных условий культивирования пользуются культурой в стационарной фазе роста.

В.1.2 Культивирование инфузорий проводят следующим способом: в чашку Петри вместимостью 50 см с минеральной средой Лозина-Лозинского (объем среды 30 см) вносят 100 шт. инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg из маточной культуры и добавляют корм (одну гранулу сухих дрожжей на данный объем). Выращивают инфузории (при постоянной температуре (24±2)°С и освещенности 500-1000 лк) в течение 3 сут. Через 3 сут, когда плотность инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg обычно достигает максимума, культуру инфузорий Пастеровской пипеткой пересаживают в чистую чашку Петри с минеральной средой Лозина-Лозинского в количестве 100 шт. на 30 см и снова добавляют корм. Таким способом получают культуру инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg, предназначенную для культивирования. Культура инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg очень долго находится в экспоненциальной фазе роста. Стационарная фаза достигается при культивировании свыше двух месяцев.

Примечание - Допускается проводить культивирование инфузорий в термобоксе, изготовленном из оргстекла, с помощью нагревательного элемента, термодатчика и терморегулятора, избегая попадания прямых солнечных лучей, или в термостате, но в этом случае необходимо установить маломощную лампу дневного света с реле времени, регулирующим освещение: 12 ч свет и 12 ч темнота.

В.2 Подготовка к тестированию Paramecium caudatum Ehrenberg

В.2.1 Оборудование и процедура получения суточной культуры

Для тестирования используют суточную культуру инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg (синхронизированная культура), которую получают в лаборатории следующим способом:

- в чашку Петри вместимостью 50 см с минеральной средой Лозина-Лозинского (объем 30 см) из емкости с маточной культурой помещают 100 шт. взрослых особей Paramecium caudatum Ehrenberg, кормят и выдерживают в течение 1 сут;