ГОСТ ISO 22160-2015 Молоко и молочные напитки. Определение активности щелочной фосфатазы. Метод с применением фотоактивной ферментной системы (EPAS)

     8 Проведение испытания (см. приложение А)

8.1 Градуировка

8.1.1 Строят градуировочную кривую для каждого типа продукта, который будут испытывать. Начинают с установки фона люминометра (Bg) на 100 и коррекции (Cr) на 100.

При осуществлении настроек применяют руководство по эксплуатации люминометра. Градуировочные кривые являются стабильными, и их следует запускать, если используют новые партии/номера партий субстрата эфира диоксетана (4.1) и останавливающий раствор (4.2). Графическое представление для градуировки приведено в приложении А.

Примечание - Режим градуировки, согласно некоторым руководствам по эксплуатации люминометра, представлен с применением этапов по 8.1.1-8.2.2 (меню градуировки представляет собой пункт 8 в главном меню). Выбирают градуировку щелочной фосфатазы. Выбирают канал для градуировки. Выбирают градуировку. Выбирают для градуировки рабочую часть пробы, например молоко, сливки или шоколад (ароматизированный молочный продукт) или другое. Люминометр подсказывает пользователю следующие этапы.

8.1.2 При испытании используют три пробирки с градуировочными пробами. Используют пипетку с фиксированным объемом (5.3), снабженную наконечником для внесения 100 мкл субстрата эфира диоксетана (4.1) на дно трех мини-пробирок (5.2).

8.1.3 Для рабочих частей проб, полученных по 7.1.2-7.1.4, пипеткой с фиксированным объемом (5.3) и чистым наконечником добавляют 100 мкл отрицательной пробы для испытания (7.2) в каждую пробирку. Содержимое пробы помещают на дно пробирки, чтобы обеспечить контакт всей пробы с субстратом. Содержимое пробирок смешивают, поместив их в штатив, возвратно-поступательными движениями примерно 10 раз в течение 5 с.

8.1.4 Мини-пробирки (8.1.3) помещают на 3 мин в блок инкубатора (5.7), установленного на температуру 35°С. В конце инкубации к содержимому всех мини-пробирок с помощью дозатора с фиксированным объемом (5.4) в течение 15 с добавляют 1,0 мл останавливающего раствора (4.2).

8.1.5 Мини-пробирки вынимают из инкубатора. Каждую пробирку накрывают колпачком и энергично встряхивают в течение 5 с. Если необходимо, отвинчивают колпачок и крепят пробирку к адаптеру люминометра. Пробирку вставляют в люминометр. При завершении подсчета (звуковой сигнал) показания люминометра (5.1) считывают и записывают. Повторяют с каждой пробиркой. Чтобы избежать загрязнения следующей пробирки, к жидким растворам с адаптером не прикасаются. Если раствор контактирует с пробиркой, ее промывают водой и сушат перед повторным использованием. Рассчитывают среднее отрицательное значение (N). Определение, описанное в 8.1.2-8.1.5, повторяют, если одно любое значение более чем на 30% отличается от среднего значения.

8.1.6 Для рабочих частей проб, полученных по 7.1.2-7.1.3, трижды повторяют каждый этап по 8.1.2-8.1.5 с градуировочным раствором С (4.3.1). Для рабочей части пробы, полученной по 7.1.4, трижды повторяют каждый этап по 8.1.2-8.1.5 с градуировочным раствором С (4.3.2). Рассчитывают среднее значение () градуировочного раствора С или С. Данное определение повторяют, если одно любое значение более чем на 30% отличается от среднего значения.

8.1.7 Рассчитывают корректирующее значение , используя среднее градуировочное значение (см. 8.1.6) и среднее отрицательное значение N (см. 8.1.5) в формуле (1). Вводят в люминометр. Пользуются руководством по эксплуатации люминометра в случае, когда необходимо узнать, как изменить коррекцию люминометра по отношению к новому числу корректирующего значения :

.            (1)

Примечание - Автоматизированные люминометры напечатают N и и автоматически рассчитают и отрегулируют значения и .

8.1.8 Рассчитывают фоновое значение с использованием и среднего отрицательного значения N в формуле (2) и вводят значение в люминометр. Пользуются руководством по эксплуатации люминометра в случае, когда необходимо узнать, как изменить фоновый режим люминометра по отношению к новому числу фонового значения :

.            (2)

Примечание - Автоматизированные люминометры напечатают N и и автоматически рассчитают и отрегулируют значения и .

8.1.9 Трижды повторяют этапы по 8.1.2-8.1.5 с отрицательной пробой для испытания (7.2). Проверяют, составляют ли любые два средних значения для молока (в мЕд/л) менее 5 мЕд/л или для ароматизированного молочного продукта и сливок менее 15 мЕд/л. Если средние значения выходят за пределы диапазона, переходят к этапу по 8.1.1.

8.1.10 Повторяют этап по 8.1.6 с градуировочными растворами C и C. Средний считывающий допустимый диапазон составляет 320 мЕд/л и 400 мЕд/л для градуировочного раствора C (C или C). Данное определение повторяют, если одно любое значение более чем на 30% отличается от среднего значения. Если среднее значение выходит за пределы диапазона, переходят к этапу по 8.1.1.

8.1.11 Выполняют градуировку (8.1.2-8.1.5), заменяя в этапе по 8.1.3 рабочий градуировочный раствор A (A или A в зависимости от рабочей части пробы, указанной в 4.3) отрицательной пробой. Определяют среднее значение для градуировочного раствора A или A. Данное определение повторяют, если одно любое значение отличается более чем на 40% от среднего значения.

8.1.12 Выполняют градуировку (8.1.6), заменяя рабочий градуировочный раствор B (B или B в зависимости от рабочей части пробы, указанной в 4.3) градуировочным раствором C на этапе по 8.1.6. Определяют среднее значение для градуировочного раствора B. Данное определение повторяют, если одно любое значение более чем на 30% отличается от среднего значения.

8.1.13 Среднее значение для рабочего градуировочного раствора A должно быть между 32 мЕд/л и 55 мЕд/л, а для рабочего градуировочного раствора A - между 45 и 110 мЕд/л. Среднее значение для рабочего градуировочного раствора B (B или B) должно быть от 145 мЕд/л до 205 мЕд/л.

Если оба градуировочных раствора находятся между указанным диапазоном, переходят к этапу по 8.3. Если любой из градуировочных растворов находится вне указанного диапазона, переходят к этапам по 8.2.1 и 8.2.2.

8.2 Регулировка градуировки

8.2.1 Регулировка градуировки для градуировочных растворов A и B

Примечание - Автоматическая градуировка выполнит данные расчеты и регулировки и быстрое повторное испытание (8.2.2).

8.2.1.1 В случаях, когда среднее значение и средние значения градуировочного раствора A, A или B немного больше или меньше (в пределах 10 мЕд/л), чем заданные диапазоны, можно увеличить или уменьшить фон, что приведет среднее значение в диапазон, не вызывая выпадения из диапазона среднего значения других градуировочных растворов (например, увеличение фона приведет к тому, что это количество вычитается из среднего значения каждого градуировочного раствора, снижение фона приведет к соответствующему увеличению среднего значения каждого градуировочного раствора). В этом случае изменяют фон люминометра на эту новую настройку фона в соответствии с формулами.

a) Когда градуировочный раствор A находится вне диапазона, используют формулу

,                                                 (3)