ГОСТ ISO 22160-2015 Молоко и молочные напитки. Определение активности щелочной фосфатазы. Метод с применением фотоактивной ферментной системы (EPAS)

     4 Реактивы

В ходе анализа используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если не установлены другие требования, и дистиллированную, деминерализованную воду или воду эквивалентной чистоты.

4.1 Субстрат нехемилюминесцентного эфира диоксетана [0,2 моль/л 3-(2'-спироадамантанан)-4-метокси-4-(3''-фосфат фенил-1,2 диоксетана динатриевой соли в DEAE-буфере с 1% флуорозина] имеется в продаже [например, жидкий реактив Charm AP ®].

_______________

Реактивы, указанные в разделе 4, и оборудование, указанное в 5.1, доступны у I Charm Sciences Inc., 659 Andover St., Lawrence, MA 01843, USA (США). Они являются примерами подходящих продуктов, доступных в продаже. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанных продуктов со стороны ISO или IDF. Могут быть использованы эквивалентные продукты, если они обеспечивают получение аналогичных результатов.

Рекомендуется хранить субстрат при температуре 0°С-7°С. При хранении в пластиковых пробирках янтарного цвета и при температуре 4°С субстрат остается стабильным в течение 6 мес. При хранении при температуре 30°С субстрат сохраняет стабильность только в течение 24 ч.

При испытаниях используемый субстрат хранят при температуре 0°С-7°С или во льду.

4.2 Останавливающий раствор

Останавливающий раствор подготавливают, смешивая одинаковое количество 0,15 моль/л 2-амино-2-метил-1-пропанола и 0,02% бензалкония хлорида с рН 10,7. До использования останавливающий раствор должен находиться при комнатной температуре 18°С-24°С. Для проверки стабильности раствора, использованного при градуировке, если не используют термозонд, фиксируют и поддерживают температуру в пределах 0,5°С.

Примечание - Останавливающий раствор используют для остановки ферментного гидролиза субстрата эфира диоксетана (4.1).

Имеющийся в продаже останавливающий раствор имеет срок годности 1 год при хранении при температуре 4°С или 2 мес при хранении при комнатной температуре. При ежедневном использовании его рекомендуется хранить при комнатной температуре.

4.3 Рабочие градуировочные средства, например, градуировочные таблетки (сухое пастеризованное молоко с измеренным содержанием фосфатазы в виде таблеток для регидратации в молоке) с активностью фосфатазы 875±26 мкЕд/л. Таблетки регидратируют в трех различных объемах напитка на основе молока, не содержащего активной фосфатазы, или в отрицательной пробе для испытания (7.2) для создания стандартной градуировочной кривой.

Имеющиеся в продаже градуировочные таблетки хранят при температуре 4°С в течение 2 лет.

4.3.1 Градуировочные средства для жидких неокрашенных молочных продуктов

В каждой из трех пробирок (5.9) вместимостью 50 мл с отметками A, B и C соответственно растворяют одну градуировочную таблетку в 100 мкл дистиллированной воды.

В пробирку A добавляют 20 мл, в пробирку B - 5 мл, в пробирку C - 2,5 мл жидкого молочного продукта белого цвета (не содержащего активной фосфатазы) или отрицательную пробу для испытания (7.2). Получают градуировочные стандарты A, B и C с активностью фосфатазы A=44 мЕд/л, B=175 мЕд/л и C=350 мЕд/л соответственно. Пробирки закрывают колпачками и энергично встряхивают их содержимое. Для регидратации содержимого пробирки выдерживают ее в холодильнике в течение 10 мин. Тщательно перемешивают перед применением.

4.3.2 Градуировочные средства для сливок и ароматизированного молока

В каждой из трех пробирок (5.9) вместимостью 50 мл с отметками A, B и C соответственно растворяют по одной градуировочной таблетке в 100 мкл дистиллированной воды.

В пробирку A добавляют 10 мл, в пробирку B - 5 мл, в пробирку C - 2,5 мл сливок или ароматизированного молока (не содержащих активной фосфатазы) или отрицательную пробу для испытания (7.2). Получают градуировочные стандарты A, B и C с активностью фосфатазы A=88 мЕд/л, B=175 мЕд/л и C=350 мЕд/л соответственно. Пробирки закрывают колпачками и энергично встряхивают их содержимое. Для регидратации содержимого пробирки выдерживают ее в холодильнике в течение 10 мин. Тщательно перемешивают перед применением.

4.4 Положительная контрольная проба

В качестве положительной контрольной пробы используют лиофилизированную щелочную фосфатазу в колбе янтарного цвета вместимостью 15 мл. Положительную контрольную пробу регидратируют с 10 мл молочного напитка, не содержащего активной фосфатазы, или подготовленной для испытания отрицательной пробой (7.2). Регидратированная положительная контрольная проба содержит 450 мЕд/л фермента фосфатазы.

Контрольную пробу оставляют на 10 мин для регидратации. Энергично встряхивают перед использованием.

Регидратированная положительная проба стабильна при хранении при температуре 0°С-7°С в течение 48 ч. Положительная контрольная проба, регидратированная с жидким молоком, стабильна в течение 2 мес в замороженном виде при температуре минус 15°С или ниже. Положительную контрольную пробу оттаивают в воде при комнатной температуре. Контрольную пробу энергично встряхивают, чтобы гомогенизировать перед использованием. Запрещается повторное замораживание положительной контрольной пробы.