ГОСТ ISO 22160-2015

     

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

Молоко и молочные напитки

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ

Метод с применением фотоактивной ферментной системы (EPAS)

Milk and milk-based drinks. Determination of alkaline phosphatase activity. Enzymatic photo-activated system (EPAS) method

МКС 07.100.30;

         67.100.01

Дата введения 2017-07-01

     

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Научно-производственным республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации" (БелГИСС)

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации по переписке (протокол от 27 февраля 2015 г. N 75-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 сентября 2016 г. N 1136-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 22160-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 22160:2007* "Молоко и молочные напитки. Определение действия щелочной фосфатазы. Метод с применением энзиматических фотоактивированных систем" ("Milk and milk-based drinks - Determination of alkaline phosphatase activity - Enzymatic photo-activated system (EPAS) method", IDT)

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Международный стандарт разработан подкомитетом SC 5 "Молоко и молочные продукты" Технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO) и Международной молочной федерацией (IDF) совместно с Международной ассоциацией химиков-аналитиков (АОАС International).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

     1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения активности щелочной фосфатазы в пастеризованном цельном молоке, частично обезжиренном молоке, обезжиренном молоке, сливках и ароматизированном молоке с применением хемилюминесцентного (EPAS) метода.

Метод применяется для молока и молочных напитков из коровьего молока, молока овец, буйволиц и коз.

Метод применяется для жидких проб, в которых после их подготовки (разбавления) активность щелочной фосфатазы составляет меньше 7000 миллиединиц на литр.

Примечание - Было проведено успешное совместное исследование с цельным коровьим молоком, молоком овец, буйволиц и коз, а также обезжиренным коровьим молоком (<0,5% жирности), 20%-ными сливками и 2%-ным молочно-шоколадным напитком).

     2 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1 активность щелочной фосфатазы; ALP (alkaline phosphatase activity): Активность щелочной фосфатазы, содержащейся в продукте, определяемая в порядке, установленном в настоящем стандарте.

Примечание - Активность щелочной фосфатазы выражается в миллиединицах активности фермента на литр (мЕд/л) ([4], [5]).

2.2 единица активности щелочной фосфатазы (unit of alkaline phosphatase activity): Количество фермента щелочной фосфатазы, которое катализирует преобразование 1 мкмоль стабильного ароматического субстрата за минуту.

     3 Сущность метода

Активность щелочной фосфатазы измеряют посредством фотоактивации гидролизованного продукта с последующим инструментальным измерением фотоактивации. В присутствии щелочной фосфатазы стабильный ароматический субстрат диоксетан-фосфата гидролизуют при температуре (35±1)°С для получения фотоактивированного (хемилюминесцентного) продукта. Фотоактивацию продукта усиливают с помощью макромолекулярного повышающего компонента. Реакцию гидролиза останавливают после определенного времени инкубации (3 мин). Количество образовавшегося хемилюминесцентного продукта измеряют и преобразуют в ферментные единицы с помощью люминометра. Градуировка люминометра основана на использовании таблеток с известной ферментной активностью.

     4 Реактивы

В ходе анализа используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если не установлены другие требования, и дистиллированную, деминерализованную воду или воду эквивалентной чистоты.

4.1 Субстрат нехемилюминесцентного эфира диоксетана [0,2 моль/л 3-(2'-спироадамантанан)-4-метокси-4-(3''-фосфат фенил-1,2 диоксетана динатриевой соли в DEAE-буфере с 1% флуорозина] имеется в продаже [например, жидкий реактив Charm AP ®].

_______________

Реактивы, указанные в разделе 4, и оборудование, указанное в 5.1, доступны у I Charm Sciences Inc., 659 Andover St., Lawrence, MA 01843, USA (США). Они являются примерами подходящих продуктов, доступных в продаже. Эта информация приводится для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой указанных продуктов со стороны ISO или IDF. Могут быть использованы эквивалентные продукты, если они обеспечивают получение аналогичных результатов.

Рекомендуется хранить субстрат при температуре 0°С-7°С. При хранении в пластиковых пробирках янтарного цвета и при температуре 4°С субстрат остается стабильным в течение 6 мес. При хранении при температуре 30°С субстрат сохраняет стабильность только в течение 24 ч.

При испытаниях используемый субстрат хранят при температуре 0°С-7°С или во льду.

4.2 Останавливающий раствор

Останавливающий раствор подготавливают, смешивая одинаковое количество 0,15 моль/л 2-амино-2-метил-1-пропанола и 0,02% бензалкония хлорида с рН 10,7. До использования останавливающий раствор должен находиться при комнатной температуре 18°С-24°С. Для проверки стабильности раствора, использованного при градуировке, если не используют термозонд, фиксируют и поддерживают температуру в пределах 0,5°С.

Примечание - Останавливающий раствор используют для остановки ферментного гидролиза субстрата эфира диоксетана (4.1).

Имеющийся в продаже останавливающий раствор имеет срок годности 1 год при хранении при температуре 4°С или 2 мес при хранении при комнатной температуре. При ежедневном использовании его рекомендуется хранить при комнатной температуре.

4.3 Рабочие градуировочные средства, например, градуировочные таблетки (сухое пастеризованное молоко с измеренным содержанием фосфатазы в виде таблеток для регидратации в молоке) с активностью фосфатазы 875±26 мкЕд/л. Таблетки регидратируют в трех различных объемах напитка на основе молока, не содержащего активной фосфатазы, или в отрицательной пробе для испытания (7.2) для создания стандартной градуировочной кривой.

Имеющиеся в продаже градуировочные таблетки хранят при температуре 4°С в течение 2 лет.

4.3.1 Градуировочные средства для жидких неокрашенных молочных продуктов

В каждой из трех пробирок (5.9) вместимостью 50 мл с отметками A, B и C соответственно растворяют одну градуировочную таблетку в 100 мкл дистиллированной воды.

В пробирку A добавляют 20 мл, в пробирку B - 5 мл, в пробирку C - 2,5 мл жидкого молочного продукта белого цвета (не содержащего активной фосфатазы) или отрицательную пробу для испытания (7.2). Получают градуировочные стандарты A, B и C с активностью фосфатазы A=44 мЕд/л, B=175 мЕд/л и C=350 мЕд/л соответственно. Пробирки закрывают колпачками и энергично встряхивают их содержимое. Для регидратации содержимого пробирки выдерживают ее в холодильнике в течение 10 мин. Тщательно перемешивают перед применением.

4.3.2 Градуировочные средства для сливок и ароматизированного молока

В каждой из трех пробирок (5.9) вместимостью 50 мл с отметками A, B и C соответственно растворяют по одной градуировочной таблетке в 100 мкл дистиллированной воды.

В пробирку A добавляют 10 мл, в пробирку B - 5 мл, в пробирку C - 2,5 мл сливок или ароматизированного молока (не содержащих активной фосфатазы) или отрицательную пробу для испытания (7.2). Получают градуировочные стандарты A, B и C с активностью фосфатазы A=88 мЕд/л, B=175 мЕд/л и C=350 мЕд/л соответственно. Пробирки закрывают колпачками и энергично встряхивают их содержимое. Для регидратации содержимого пробирки выдерживают ее в холодильнике в течение 10 мин. Тщательно перемешивают перед применением.

4.4 Положительная контрольная проба

В качестве положительной контрольной пробы используют лиофилизированную щелочную фосфатазу в колбе янтарного цвета вместимостью 15 мл. Положительную контрольную пробу регидратируют с 10 мл молочного напитка, не содержащего активной фосфатазы, или подготовленной для испытания отрицательной пробой (7.2). Регидратированная положительная контрольная проба содержит 450 мЕд/л фермента фосфатазы.

Контрольную пробу оставляют на 10 мин для регидратации. Энергично встряхивают перед использованием.

Регидратированная положительная проба стабильна при хранении при температуре 0°С-7°С в течение 48 ч. Положительная контрольная проба, регидратированная с жидким молоком, стабильна в течение 2 мес в замороженном виде при температуре минус 15°С или ниже. Положительную контрольную пробу оттаивают в воде при комнатной температуре. Контрольную пробу энергично встряхивают, чтобы гомогенизировать перед использованием. Запрещается повторное замораживание положительной контрольной пробы.

     5 Оборудование

Для проведения измерений используют стандартное лабораторное оборудование, а также оборудование, указанное ниже.

5.1 Люминометр, способный работать на длине волны 540 нм, с линейными выходными данными, преобразуемыми внутренним программным обеспечением в активность фермента [например, Charm Luminometer ® модели NovaLum, Luminator К или Т]. Необходимо для пробирки к моделям NovaLum и Lum-T использовать адаптер в поддерживающем положении. Датчик температуры, обеспечиваемый NovaLum, используют для измерения температуры останавливающего раствора (4.2).

Измерения должны быть оптимизированы в соответствии с рекомендациями изготовителя для используемого оборудования.

5.2 Мини-пробирки, одноразовые, сделанные из нелюминесцентного пластика, с колпачками, вместимостью 2 мл.

5.3 Пипетка с фиксированным объемом, вместимостью 100 мкл.

5.4 Дозатор с фиксированным объемом, способный дозировать 1,0 мл. Перед применением необходимо убедиться, что объем дозированной воды составляет (1,00±0,05) г.

5.5 Мерные колбы с одной меткой, вместимостью 100 мл.

5.6 Аналитические весы, способные взвешивать с точностью до 1 мг.

5.7 Блок инкубатора или термостат для сушки, способные работать при температуре (35±1)°С и (63±0,2)°С с ячейками размером мини-пробирки.

5.8 Водяная баня, регулируемая, способная поддерживать температуру (63±0,2)°С и (95±2)°С.

5.9 Пробирки, вместимостью 50 мл, диаметром 13 мм и длиной 100 мм, с герметичными крышками.