Методические указания по лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота

     2. Взятие и подготовка материала для исследования

2.1. В лабораторию для исследования направляют патологический материал от больных животных, взятый в период максимального проявления у них клинических признаков (температурная реакция, угнетение, воспалительные процессы в верхних дыхательных путях, сопровождающиеся серозными или слизистыми истечениями из носовой полости, поносы, иногда аборты), или от вынужденно убитых или павших животных, взятый не позднее чем через 2 ч после их гибели.

2.2. От больных животных берут: 1) тампонами мазки со слизистой носовой полости (при ИРТ - со слизистой глаз, влагалища, препуция) для реакции иммунофлуоресценции и для выделения возбудителя; 2) фекалии - для выделения возбудителя и 3) пробы крови - для выявления в ней титра антител.

Тампоны с материалом помещают в пенициллиновые флаконы с 2…5 мл питательной среды для культуры клеток или раствора Хенкса, содержащие 1000 ЕД/мл пенициллина и 1000 мкг/мл стрептомицина.

Кровь в объеме не менее 5,0 мл берут в пробирки, после свертывания доставляют в лабораторию.

2.3. От павших и вынужденно убитых животных берут кусочки носовой перегородки, трахеи, легких, селезенки, почки, средостенные и брыжеечные лимфатические узлы и при поносах - кусочки тонкого отдела кишечника. От абортированных плодов берут кусочки паренхиматозных органов, околоплодную жидкость.

2.4. Флаконы с патологическим материалом доставляют в лабораторию в термосе со льдом.

2.5. В лаборатории флаконы с тампонами встряхивают 2...3 мин, тампоны отжимают и удаляют, а содержимое флакона центрифугируют при 2 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку, куда вносят по 500 ЕД/мл пенициллина и 500 мкг/мл стрептомицина, выдерживают при 4°С в течение 2...4 ч и используют для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов. Из осадка центрифугата готовят мазки для исследования методом иммунофлуоресценции.

2.6. Флаконы с фекалиями замораживают при температуре -20°С (в морозилке холодильника) в течение 18 ч, после чего оттаивают при 37°С и центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку, вносят 1000 ЕД/мл пенициллина, 1000 мкг/мл стрептомицина и 50 ЕД/мл нистатина, выдерживают при 4°С в течение 2...4 ч, дополнительно центрифугируют и используют для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов.

2.7. Со слизистой носовой перегородки, трахеи, влагалища, бронхов и кишечника делают скальпелем соскобы, вносят их в центрифужную пробирку с 5 мл физиологического раствора и центрифугируют при 2 тыс. об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток суспендируют в 0,5 мл того же раствора и готовят мазки на обезжиренных предметных стеклах для исследования методом иммунофлуоресценции.

Из кусочков легкого и лимфатических узлов готовят отпечатки на предметных стеклах или срезы толщиной 5 микрон для исследования тем же методом.

2.8. Из кусочков органов готовят 10...20%-ную суспензию для выделения возбудителя и приготовления комплементсвязывающего и преципитирующего антигенов.

2.9. Для получения суспензии (с целью выделения вируса) ткань измельчают, растирают в ступке со стеклянным песком, разводят раствором Хенкса, содержащим антибиотики, центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, выдерживают при температуре 4°С в течение 2...4 ч и используют для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов.

2.10. Для изготовления испытуемого комплементсвязывающего антигена ткань измельчают в ступке или специальном микроизмельчителе, разводят 1:5 содержащим антибиотики физиологическим раствором, рН 7,2...7,4. Полученную 20%-ную суспензию замораживают при температуре -20°С в течение 16...18 ч, быстро оттаивают при температуре 37°С, повторно растирают или гомогенизируют, а затем центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и далее используют, как указано в п.5.1.