ГОСТ EN 14164-2014 Продукты пищевые. Определение витамина В(6) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (Переиздание)

     4 Реактивы

4.1 Общие положения

Для испытаний используют реактивы гарантированной чистоты и воду не ниже 1-й степени чистоты в соответствии с EN ISO 3696.

4.2 Реактивы

4.2.1 Кислая фосфатаза из картофеля, ферментная активность составляет 33 нанокатал/мг* с субстратом нитрофенилфосфатом (при рН = 4,8 и температуре 37°С), например, производства Boehringer или Sigma. Активность 33 нанокатал/мг соответствует 2 U/мг.

_______________

* Катал (обозначается "кат") - единица измерения активности катализатора в системе СИ. Активность катализатора в один катал увеличивает скорость реакции на один моль/с в заданных условиях.

4.2.1.1 Раствор кислой фосфатазы

Готовят раствор кислой фосфатазы в растворе ацетата натрия (см. 4.2.14) массовой концентрации 20 мг/см.

Необходимо использовать кислую фосфатазу, а не Така-диастазу для достижения полного гидролиза фосфорилированных форм витамина . Там, где требуется 300 мг Така-диастазы для получения хорошего дефосфорилирования, кислой фосфатазы потребуется всего 0,5 мг (см. [5]).

4.2.1.2 Проверка активности кислой фосфатазы

Проверяют активность каждой новой партии кислой фосфатазы следующим образом. Готовят исходный раствор пиридоксальфосфата массовой концентрации 0,1 мг/см (см. 4.2.9) в воде. Отбирают для экстракции 5,0 см этого раствора и проводят операции, предусмотренные в 6.2.1, 6.2.2, 6.2.3, 6.2.4 и 7.

Рассчитывают коэффициент извлечения пиридоксина из этого раствора и делят на теоретическое количество пиридоксина, выделенного из пиридоксальфосфата. Вычисляют теоретическую массовую концентрацию пиридоксина , мг/см, выделенного из пиридоксальфосфата по формуле:

,                                       (1)

где - массовая концентрация пиридоксальфосфата, определенная спектрофотометрическим методом в УФ-области;

- молярная масса образца сравнения витамина - пиридоксина (169,1), г/моль;

2 - коэффициент разбавления при реакции с борогидритом натрия;

5,0 - объем раствора, взятого для экстракции (см. 4.2.1.2), см;

100 - общий объем исследуемого раствора пробы, см;

- молярная масса пиридоксальфосфата (265,16), г/моль.

Смешивают 3,0 см исходного раствора пиридоксальфосфата и 10 см соляной кислоты (см. 2.21) в мерной колбе вместимостью 20 см и разбавляют до метки водой. Проверяют концентрацию пиридоксальфосфата путем измерения поглощения при 295 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, используя спектрофотометр для УФ-области спектра (см. 5.2) относительно раствора соляной кислоты (см. 4.2.20). Молярный коэффициент поглощения () пиридоксальфосфата в растворе соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм равен 8353.

Рассчитывают массовую концентрацию исходного раствора пиридоксальфосфата , мг/см, по формуле:

,                                          (2)

где - оптическая плотность раствора при 295 нм;

- молярная масса пиридоксальфосфата (265,16), г/моль;

- коэффициент разбавления (в данном случае 20/3);

- молярный коэффициент поглощения пиридоксальфосфата в 0,1 моль/дм соляной кислоты при 295 нм, дммольсм (8353).