ГОСТ Р ИСО 29701-2015 Нанотехнологии. Наноматериалы для испытаний в тест-системах in vitro. Метод определения содержания эндотоксинов с использованием лизата амебоцитов Limulus (ЛАЛ-тест)

     6 Приготовление испытуемой пробы

В программах и методиках испытаний должны быть установлены требования к приготовлению испытуемых проб. Сведения о применяемых методах отбора и подготовки пробы регистрируют в протоколе испытаний.

6.1 Метод диспергирования

Приготовление испытуемой пробы методом диспергирования выполняют с учетом цели испытаний и требований, установленных для испытаний с использованием конкретной тест-системы in vitro. Пробу наноматериала измельчают вручную, механизированным способом или ультразвуком, затем диспергируют в воде для ЛАЛ-теста НСЭ.

Примечание - Следует учитывать, что процесс диспергирования может быть затруднен вследствие наличия у наноматериалов таких характеристик, как большая удельная площадь поверхности, пористость, гидрофобность.

6.2 Метод экстрагирования

Приготовление испытуемой пробы методом экстрагирования выполняют с учетом требований, установленных для испытаний с использованием конкретной тест-системы in vitro. Экстрагирующие растворы, время и температура инкубирования, концентрация испытуемой пробы должны соответствовать требованиям, установленным для испытаний с использованием конкретной тест-системы in vitro. Для контроля значений рН не рекомендуется применять феноловый красный индикатор, влияющий на цвет раствора. Контроль значений рН следует выполнять с применением буферных растворов. Для подготовки испытуемой пробы допускается применять готовые сертифицированные или самостоятельно приготовленные из реактивов НСЭ экстрагирующие растворы НСЭ. Во избежание роста бактерий и плесневых грибов допускается в экстрагирующие растворы добавлять антибиотики и фунгициды. Следует учитывать, что применяемые антибиотики и фунгициды могут являться мешающими факторами и оказывать влияние на результаты ЛАЛ-теста (см. 7.3.3). После проведения экстрагирования полученную смесь центрифугируют с целью удаления частиц. Образовавшийся супернатант переносят с помощью пипеток в пробирки или контейнеры. Отобранный супернатант представляет собой экстракт наноматериала.

Примечания

1 Для удаления эндотоксинов со стекловолоконных фильтров, применяемых для фильтрации проб, можно использовать 0,05% полисорбат 20 [9].

2 Для удаления эндотоксинов из углеродных наноматериалов рекомендуется применять поверхностно-активные вещества, например раствор витамина Е массовой долей 0,1% (-токоферол полиэтиленгликоль-1000 сукцината) [10].

3 При приготовлении испытуемой пробы методом экстрагирования допускается использовать дополнительные сведения [1].

6.3 Концентрация наноматериала в испытуемой пробе

Концентрация наноматериала в испытуемой пробе должна быть максимально высокой и соответствовать требованиям, установленным для испытаний с использованием конкретной тест-системы in vitro.

6.4 Хранение испытуемой пробы

Во избежание разрушения эндотоксинов и/или роста бактерий приготовление испытуемой пробы рекомендуется осуществлять непосредственно перед проведением ЛАЛ-теста.

В случае если сразу провести ЛАЛ-тест невозможно, то хранение испытуемой пробы осуществляют в стерильных герметичных контейнерах (см. 4.2) при температуре от 2 до 8°С. В случае хранения испытуемой пробы более 24 ч выполняют проверку ее стабильности и однородности. Требования к хранению испытуемых проб должны быть установлены в программах и методиках испытаний.

6.5 Условия проведения отбора, подготовки проб и испытаний

6.5.1 Воздух окружающей среды

Требования к чистоте воздуха окружающей среды в рабочих зонах и помещениях в целом, предназначенных для проведения отбора, подготовки проб и испытаний, должны быть установлены в программах и методиках испытаний.

Отбор, подготовку проб и испытания следует проводить в вытяжном шкафу или помещениях, оснащенных оборудованием, обеспечивающим класс чистоты 5 ИСО [2]-[4].

6.5.2 Посуда, оборудование и материалы

Для отбора, подготовки проб и проведения испытаний используют посуду, оборудование и материалы НСЭ. Для удаления эндотоксинов посуду, оборудование и материалы подвергают термической обработке при температуре не менее 250°С в течение 30 мин. Термическую обработку посуды, оборудования и материалов допускается выполнять при других значениях температуры, например проводить термическую обработку при температуре 180°С в течение 3 ч или при температуре 650°С в течение 1 мин. Требования к условиям термической обработки посуды, оборудования и материалов должны быть установлены в программах и методиках испытаний. Посуду, оборудование и материалы, непригодные для термической обработки, вымачивают в растворе щелочи или кислоты, затем промывают водой и проверяют на содержание эндотоксинов. Требования к обработке посуды, оборудования и материалов щелочью или кислотой должны быть установлены в программах и методиках испытаний. Допускается применять стерильные пластмассовые посуду и оборудование (например, контейнеры, пробирки, наконечники для микропипеток) однократного применения.

Примечание - Пластмассовые материалы, посуда и оборудование, применяемые для отбора, подготовки проб и проведения испытаний, должны быть изготовлены из полистирола.

6.5.3 Вода, используемая для промывки посуды, оборудования и материалов

Посуду, оборудование и материалы после обработки растворами щелочи или кислоты промывают дистиллированной водой НСЭ [11].