ГОСТ Р ИСО 29701-2015 Нанотехнологии. Наноматериалы для испытаний в тест-системах in vitro. Метод определения содержания эндотоксинов с использованием лизата амебоцитов Limulus (ЛАЛ-тест)

     7 Методы испытаний

7.1 Сущность ЛАЛ-теста

Эндотоксины, активируя фактор в ЛАЛ-реактиве, запускают протеолитический каскад [12]. Свертывающий фермент, высвобождаемый из профермента одним из активных факторов, катализирует протеолиз коагулогена в ЛАЛ-реактиве. Образующиеся в результате протеолиза фрагменты коагулогена - коагулины - взаимодействуют друг с другом посредством дисульфидных связей, вызывая помутнение прозрачного испытуемого раствора и увеличение его вязкости вплоть до формирования плотного геля. Образование плотного геля служит индикатором наличия в испытуемой пробе эндотоксинов. Проводимый таким образом анализ называют гель-тромб тестом. Результат испытаний наноматериалов гель-тромб тестом (образование плотного геля, который не разрушается при аккуратном однократном переворачивании пробирки) определяют визуально.

Гель-тромб тест - наиболее простой и экономичный метод испытаний, при проведении которого не требуется применение спектрофотометра. Чувствительность гель-тромб теста с использованием готовых реактивов составляет 0,015 ЕЭ/мл. Гель-тромб тест является основным методом испытаний по выявлению наличия и определению количественной концентрации эндотоксинов в наноматериалах. Допускается проводить испытания наноматериалов альтернативными методами при условии, что результаты не противоречат результатам основного метода.

Примечание - Описание гель-тромб теста приведено в приложении В.

7.2 Альтернативные методы испытаний

7.2.1 Сущность фотометрических методов по конечной точке

В фотометрических методах по конечной точке измеряют оптическую плотность (ОП) испытуемых растворов к концу инкубационного периода. Фотометрические методы подразделяют на хромогенный метод по конечной точке и турбидиметрический метод по конечной точке. Хромогенный метод по конечной точке основан на количественной зависимости концентрации эндотоксинов от количества хромофора, п-нитроанилина (p-NA), высвободившегося из хромогенного субстрата Boc-Leu-Gly-Arg-p-NA или Boc-Thr-Gly-Arg-p-NA к концу инкубационного периода. Турбидиметрический метод по конечной точке основан на количественной зависимости концентрации эндотоксинов от степени мутности (поглощение или пропускание) испытуемого раствора в конце инкубационного периода. Недостатками турбидиметрического метода по конечной точке являются низкая чувствительность и сложность остановки реакции в заданный момент времени. Поэтому для определения концентрации эндотоксинов в наноматериалах целесообразнее использовать турбидиметрический кинетический метод (см. 7.2.2). Значение ОП p-NA в испытуемых растворах измеряют при длине волны 405 нм. Интенсивность окраски испытуемых растворов в пурпурный цвет диазотированным производным p-NA измеряют при длине волны от 540 до 550 нм.

Чувствительность фотометрических методов по конечной точке с использованием готовых реактивов при измерении значений ОП p-NA при длине волны 405 нм составляет 0,01 ЕЭ/мл, при измерении интенсивности окраски испытуемых растворов в пурпурный цвет диазотированным производным p-NA - 0,001 ЕЭ/мл.

Примечание - Описание фотометрического метода по конечной точке (хромогенного метода по конечной точке) приведено в приложении С.

7.2.2 Сущность кинетических методов

Кинетические методы подразделяют на турбидиметрический кинетический метод и хромогенный кинетический метод. В процессе испытаний кинетическими методами измеряют время, необходимое для достижения заданного значения ОП, или степени мутности, или скорость окрашивания испытуемых растворов. Измерения выполняют спектрофотометром или микропланшетным фотометром. Значения ОП p-NA, или скорость окрашивания, или степень мутности испытуемых растворов в ходе испытаний регистрируют несколько раз через заданные интервалы времени. Для определения концентрации эндотоксинов в наноматериале применяют измерительные системы, с помощью которых можно одновременно инкубировать испытуемые растворы, измерять ОП и выполнять обработку результатов. Чувствительность кинетических методов с применением измерительных систем составляет 0,001 ЕЭ/мл.

Примечание - Описание кинетических методов приведено в приложении D.

7.3 Выбор метода испытаний и факторы, влияющие на достоверность результатов испытаний

7.3.1 Минимальное значение чувствительности ЛАЛ-теста