ГОСТ 33675-2015 Животные. Лабораторная диагностика бруцеллеза. Бактериологические методы (с Поправками)

     9 Идентификация выделенных культур

9.1 Пластинчатая реакция агглютинация

9.1.1 Подготовка к исследованию

9.1.1.1 Подготовка двухсуточных культур бруцелл

Для идентификации используют двухсуточные агаровые культуры (изоляты) бруцелл, выделенные из патологического материала. С этой целью выделенные культуры пересевают бактериологической петлей штрихом на поверхность плотной питательной среды по 8.2.4, 8.2.6, скошенной в пробирках. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С-38°С в течение двух суток. Выращенные культуры исследуют непосредственно после извлечения из термостата.

Примечание - Допустимый срок хранения культур при температуре от 2°С до 8°С - не более 14 сут.

9.1.1.2 Подготовка R- и S-бруцеллезных агглютинирующих сывороток

R- и S-бруцеллезные агглютинирующие сыворотки разводят 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором до рабочего разведения. Разведенные сыворотки хранят при температуре от 2°С до 8°С и используют в течение 30 сут.

9.1.2 Проведение исследования

На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R- и S-бруцеллезных сывороток по 9.1.1 и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно перемешивают в капле S-, R-бруцеллезной сыворотки и физиологического раствора. Параллельно ставят контроли: со стандартными S- и R-бруцеллезными сыворотками и гомологичными антигенами.

9.1.3 Учет и оценка результатов реакции агглютинации

При положительной РА в капле сыворотки образуется четко выраженный агглютинат в виде хлопьев или комочков, а жидкость просветляется, что особенно заметно при покачивании стекла. В физиологическом растворе наблюдается гомогенная взвесь без признаков просветления жидкости.

Реакцию учитывают визуально в течение 1-3 мин и оценивают в крестах:

- "++++" (четыре креста) - полное просветление жидкости с образованием четко выраженного агглютината - положительная реакция;

- "+++" (три креста) - неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом - положительная реакция;

- "++" (два креста) - неполное просветление жидкости со слабо выраженным агглютинатом - положительная реакция;

- "+" (один крест) - жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом - сомнительная реакция;

- "-" (минус) - просветление жидкости не наступило, смесь гомогенная - отрицательная реакция.

Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях R- и S-бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее чем на два креста, а с физиологическим раствором - отсутствует.

9.1.4 Обработка результатов

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, культуральными (см. раздел 8) и тинкториальными свойствами (см. раздел 7), а также дающие положительную реакцию агглютинации с S- или R-бруцеллезной сывороткой или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе, считают бруцеллами.

9.2 Методы определения диссоциации культур бруцелл

9.2.1 Проба на стекле с раствором акрифлавина

На предметное стекло наносят каплю раствора акрифлавина в разведении 1:1000 в дистиллированной воде, в которой суспензируют с помощью бактериологической петли испытуемую культуру. У диссоциированных культур (R-форма) в течение 1-2 мин наступает агглютинация с образованием хорошо выраженных хлопьев. Взвесь культур бруцелл в S-форме остается гомогенной.

9.2.2 Реакция термоагглютинации

Взвесь двухсуточной агаровой культуры бруцелл в физиологическом растворе по 9.1.1 с содержанием по оптическому стандарту мутности 1 млрд/см микробных клеток в объеме 4-5 см прогревают в пробирке вместимостью 20 см на водяной бане при температуре 90°С в течение 30 мин.

Результаты учитывают через 30 мин, 1 ч и через 24 ч при комнатной температуре.

При наличии диссоциации наступает выраженная агглютинация клеток бруцелл с формированием осадка, тогда как суспензия недиссоциированной культуры бруцелл в S-форме остается гомогенной.

9.2.3 Окраска колоний по Уайт-Вилсону

Двухсуточную агаровую культуру бруцелл по 9.1.1 разводят физиологическим раствором с таким расчетом, чтобы она по мутности соответствовала 10 ЕД оптического стандарта мутности. Полученную суспензию в объеме 3 см смешивают с 2 см физиологического раствора и делают десятикратные разведения до 10, используя для каждого разведения отдельную пипетку, и высевают по 0,1 см на четыре-шесть чашек Петри с МППГГА. Поверхность агара в чашках равномерно орошают посевным материалом, выдерживают на горизонтальной поверхности стола в течение 20-30 мин и инкубируют при температуре 37°С-38°С агаром вверх в течение 4-5 сут.