ГОСТ 33163-2014 Продукция соковая. Определение бактерий рода Alicyclobacillus

Приложение Б
(рекомендуемое)

     
Пероксидазный тест на подтверждение наличия гваякола

Б.1 Сущность

Пероксидазный тест может применяться для подтверждения способности исследуемых микроорганизмов образовывать гваякол из ванилиновой кислоты. Такие виды, как А. acidoterrestris, A. acidiphilus, A. herbarius и пр., могут давать положительные результаты в данном тесте, но необязательно будут продуцировать гваякол во всей соковой продукции. Такие виды, как A. acidocaldarius, дают отрицательный результат в этом тесте. Поскольку результаты могут варьироваться в зависимости от активности исследуемой культуры и видов, важно включить в тест положительные и отрицательные контрольные культуры, т.е. A. acidoterrestris и A. acidocaldarius, соответственно, которые были выращены в тех же условиях, что и тестируемые колонии.

Определение основано на изменении цвета среды YSG с ванилиновой кислотой после реакции окисления пероксидом водорода. Реакция окисления катализируется пероксидазой. Гваякол окисляется до органического соединения красно-коричневого цвета, 3,3'-диметокси-4,4'-дифенилхинона (тетрагваякол) по следующей схеме:

Использование YSG-бульона с ванилиновой кислотой позволяет за короткий промежуток времени накопить концентрации гваякола на уровне 10 мг/дм.

Б.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы

Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы - по разделу 6.

Б.3 Приготовление реагентов*

_______________

* Набор для пероксидазного теста выпускается компаниями Doehler и Kyokuto Pharmaceutical Industrial Со Ltd, Япония. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта, не является рекламой указанных реагентов и не исключает возможность применения других наборов.

Б.3.1 Для проведения пероксидазного теста на наличие гваякола используют следующие реактивы:

- кислота 4-гидрокси-2-метоксибензойная (ванилиновая), СНО, с массовой долей основного вещества не менее 97%;

- пероксид водорода по ГОСТ 10929 с массовой долей пероксида водорода 29%-35%;

- пероксидаза хрена, лиофилизированный препарат с показателем чистоты RZ3, раствор с ферментативной активностью 5 Е/мг;

- кислота лимонная по ГОСТ 3652, раствор с массовой концентрацией 200 г/дм, готовят по ГОСТ 10444.1;

- калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198 или двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493.

Б.3.2 Приготовление YSGVA-бульона с содержанием 250 мг/дм ванилиновой кислоты

Взвешивают на весах 0,125 г ванилиновой кислоты и растворяют в стакане при перемешивании в 500 см YSG-бульона.

Стерилизуют бульон путем автоклавирования в течение 10 мин при температуре 120°С. После автоклавирования разливают по 2 см в пробирки.

Б.3.3 Приготовление фосфатного буферного растовора

97 г двузамещенного фосфорнокислого натрия растворяют в мерной колбе вместимостью 500 см в дистиллированной воде, доводят до метки и перемешивают.

Стерилизуют путем автоклавирования в течение 10 мин при температуре 120°С.

Буферный раствор хранят в склянке из темного стекла с плотно закрытой пробкой - не более 1 мес.

Б.3.4 Приготовление раствора пероксида водорода с объемной долей 1%

3,5 см пероксида водорода переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят объем дистиллированной водой до метки.

Раствор готовят непосредственно перед применением.