ГОСТ 32643-2014 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Токсичность подострая ингаляционная: 28-дневное исследование (Переиздание)

     2 Описание метода

2.1 Животные
     

    2.1.1 Выбор видов

В качестве подопытных следует использовать молодых здоровых половозрелых грызунов из обычно применяемых лабораторных линий. Предпочтительно использовать крыс. Использование других видов необходимо обосновать.

2.1.2 Подготовка

Самки должны быть нерожавшими и небеременными. На день отбора для эксперимента животные должны быть в возрасте от семи до девяти недель. Диапазон колебания массы тела животных для каждого пола не должен превышать ±20% средней массы тела всех животных, применяемых в исследовании, отдельно каждого пола. Животных отбирают в случайном порядке и маркируют, что позволяет идентифицировать каждое из них, и содержат в клетках в течение пяти дней до начала испытания для адаптации к лабораторным условиям.

2.1.3 Условия содержания и кормления

Животных следует помечать индивидуальными идентификаторами, если возможно, подкожными маяками-ответчиками, чтобы облегчить процесс наблюдения и избежать путаницы. Температура в помещении с экспериментальными животными должна составлять (22±3)°С. Относительная влажность должна варьироваться между 30% и 70%, но это может быть недостижимо, если в качестве растворителя используют воду. Перед и после воздействия животных, как правило, следует содержать в клетках группами одного пола и одной концентрации, но число животных в клетке не должно затруднять наблюдения за каждым животным и должно минимизировать вероятность потерь от каннибализма и борьбы. Если животные подвергаются воздействию только через нос, им может потребоваться привыкнуть к дыхательной трубке. Дыхательные трубки не должны вызывать у животных физический или температурный стресс или приводить к потере подвижности. Если данные показывают, что подобные изменения не являются значимыми, то адаптация к дыхательным трубкам не является необходимой. Животных, подвергающихся воздействию аэрозолем через все тело, следует содержать индивидуально на протяжении периода экспозиции, чтобы уберечь их от проникновения тестируемого аэрозоля через шерстку партнеров по клетке. Могут применять традиционные и проверенные лабораторные диеты за исключением периода экспозиции испытуемого препарата, во время которого для животного необходимо обеспечивать неограниченное количество питьевой воды. Освещение должно быть искусственным в режиме 12 ч при свете/12 ч в темноте.

2.2 Ингаляционная камера

Природа исследуемого препарата и предмет исследования должны быть учтены при выборе ингаляционной камеры. Предпочтительной моделью воздействия является воздействие через нос (данный термин обозначает воздействие "только через голову", "только через нос", "только через мордочку"). Экспозиция "только через нос", как правило, предпочтительна при исследованиях жидких или твердых аэрозолей, а также для паров, которые могут конденсироваться и образовывать аэрозоль. Специальные цели исследования могут быть достовернее достигнуты при модели воздействия "через все тело", но применение такой модели должно быть обосновано в отчете об исследовании. Чтобы обеспечить атмосферную стабильность при применении камеры для воздействия "через все тело", общий объем испытуемых животных не должен превышать 5% объема камеры. Методика воздействий "только через нос" и "через все тело", а также их положительные и отрицательные особенности отражены в документе [2].

2.3 Исследование токсичности

2.3.1 Предельные концентрации

В отличие от исследований острой токсичности в исследованиях 28-дневной подострой ингаляционной токсичности уровень предельных концентраций не задан. Максимально тестируемая концентрация должна учитывать:

1) максимально достигаемую концентрацию;

2) при воздействии на человека уровень, при котором разворачивается наиболее неблагоприятный сценарий;

3) необходимость поддерживать соответствующий объем кислорода; и/или

4) соображения о защите животных.

В отсутствие данных о предельных концентрациях можно применять предельные концентрации для острой токсичности в соответствии с Согласованной на глобальном уровне системой классификации и маркировки химических веществ ООН (т.е. вплоть до максимальной концентрации 5 мг/л для аэрозолей, 20 мг/л для паров и 20,000 ppm для газов); см. документ [2]. Если при тестировании газов или высоко летучих исследуемых препаратов (например, жаропонижающие средства) возникла необходимость превысить предельные концентрации, следует привести обоснование. Предельная концентрация должна вызывать явную интоксикацию, не приводя к чрезмерному стрессу у животных и не влияя на продолжительность их жизни [3].

2.3.2 Исследование по определению доз

Прежде чем приступить к основному исследованию, может возникнуть необходимость в определении диапазона концентраций для исследования. Определение диапазона концентраций является более полным для исследования, нежели визуальное изучение, потому что оно не ограничено отбором концентраций. Информация, полученная в результате определения диапазона концентраций для исследования, может помочь провести основное исследование более успешно. Определение диапазона концентраций для исследования может, например, дать информацию об аналитических методах, об измерении частиц, об обнаружении механизмов интоксикации, данные клинической патологии и гистопатологии, расчеты, какими могут быть концентрации NOAEL (уровень отсутствия наблюдаемого вредного воздействия после введения вещества, максимальной дозы, не вызывающей обнаруживаемого вредного воздействия на здоровье) и МТС (минимальная токсическая концентрация) в основном исследовании. Руководитель исследования по определению диапазона концентраций может применять для установления порога раздражения дыхательных путей (например, с помощью гистопатологии дыхательных путей, тестирования легочной функциональной пробы или бронхоальвеолярного лаважа), наивысшей концентрации, которая не вызывает стресса у животных и изменения параметров, которые наиболее полно характеризуют токсичность исследуемого вещества.

Определение диапазона концентраций может состоять из одного или более уровней концентрации. Не более трех самцов и трех самок следует подвергать воздействию каждого уровня концентрации. Определение диапазона концентраций должно длиться не менее пяти, но, как правило, не более 14 дней. Обоснование выбора концентрации для основного исследования необходимо отразить в отчете по основному исследованию. Цель основного исследования - выявление зависимости "концентрация-ответ", базирующейся на основе наиболее чувствительных показателей. Низкий уровень концентрации в идеале не должен вызывать наблюдаемого токсического эффекта, тогда как высокий уровень концентрации должен вызывать явную токсичность, не приводя к чрезмерному стрессу у животных и не влияя на продолжительность их жизни [3].

При выборе уровня концентрации для определения диапазона концентраций вся имеющаяся информация, включая данные о зависимости активности препарата от структуры вещества и данные по сходным химикатам, должны быть учтены (см. раздел 1). Определение диапазона концентраций может подтверждать/опровергать то, какие показатели являются наиболее чувствительными, например ингибирование холинэстеразы для органофосфатов, образование метагемоглобина путем эритроцитотоксических агентов, тиреоидные гормоны (,) для тиреотоксинов, белок, лактатдегидрогеназа (LDH) или нейтрофилы в бронхоальвеолярном лаваже для безвредных плохо растворимых частиц или аэрозолей с легочно-раздражающим действием.

2.3.3 Основное исследование

Основное исследование подострой токсичности, как правило, состоит из трех уровней концентрации, а также, при необходимости, из параллельно проводимого негативного контроля (воздушного) и/или исследования среды (см. пункт 2.3.4). Все имеющиеся данные следует применять для выбора надлежащего уровня экспозиции, включая результаты системных токсикологических исследований, метаболизма и кинетики (внимание необходимо уделить тому, чтобы избежать уровней высоких концентраций, которые усиливают кинетические процессы). Каждая испытуемая группа состоит из 10 грызунов (5 самцов и 5 самок), которых подвергают воздействию тестируемого вещества ежедневно на протяжении шести часов, пять дней в неделю в течение четырех недель (общая продолжительность исследования - 28 дней). Животных могут подвергать воздействию также семь дней в неделю (например при тестировании вдыхаемых фармацевтических продуктов). Если известно, что один пол более чувствителен к воздействию тестируемого вещества, животные разных полов могут подвергаться воздействию различных уровней концентраций с целью оптимизировать зависимость "концентрация-ответ". Если воздействию "только через нос" подвергают грызунов других видов, помимо крыс, то можно отрегулировать максимальную продолжительность воздействия для минимизации дистресса, характерного для данного вида. Если продолжительность экспозиции составляет менее шести часов в день или, при необходимости, применяют долгосрочное (например, 22 ч в день) исследование с воздействием "через все тело", следует привести обоснование (см. документ [2]). Во время экспозиции рекомендуется голодание животных, если только экспозиция не превышает шести часов. Во время воздействия "через все тело" животным можно давать воду.

Выбранные целевые концентрации должны идентифицировать органы-мишени и показывать четкую зависимость "концентрация-ответ":

- высокий уровень концентрации должен вызывать токсический эффект, но не приводить к затяжным признакам интоксикации или летальности, что может препятствовать правильной оценке;

- средний(е) уровень (уровни) концентрации должен быть между низким и высоким уровнями концентрации для градации токсических эффектов;

- низкий уровень концентрации должен вызывать слабые эффекты или вообще не вызывать признаков интоксикации.

2.3.4 Вспомогательное (реверсивное) исследование